RNA 的提取和 cDNA 合成原理和实验方法 第一节. 概述 从真核生物的组织或细胞中提取 mRNA,通过酶促反应逆转录合成 cDNA 的第一链和第二链,将双链 cDNA 和载体连接,然后转化扩增, 即可获得 cDNA 文库,构建的 cDNA 文库可用于真核生物基因的结构、表达和调控的分析;比较 cDNA 和相应基因组 DNA 序列差异可确定内含子存在和了解转录后加工等一系列问题。总之 cDNA 的合成和克隆已成为当今真核分子生物学的基本手段。自 70 年代中叶首例 cDNA 克隆问世以来,已发展了许多种提高cDNA 合成效率的方法,并大大改进了载体系统，目前cDNA 合成试剂已商品化。cDNA 合成及克隆的基本步骤包括用反转录酶合成 cDNA 第一链,聚合酶合成 cDNA 第二链,加入合成接头以及将双链 DNA 克隆到于适当载体(噬菌体或质粒)。 一.RNA 制备 模板mRNA 的质量直接影响到cDNA 合成的效率。由于 mRNA 分子的结构特点,容易受RNA 酶的攻击反应而降解,加上RNA 酶极为稳定且广泛存在,因而在提取过程中要严格防止RNA 酶的污染,并设法抑制其活性,这是本实验成败的关键。所有的组织中均存在 RNA 酶,人的皮肤、手指、试剂、容器等均可能被污染，因此全部实验过程中均需戴手套操作并经常更换（使用一次性手套）。所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中 200℃烘烤 2 小时以上。凡是不能用高温烘烤的材料如塑料容器等皆可用 0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液处理,再用蒸馏水冲净。DEPC 是RNA 酶的化学修饰剂,它和 RNA 酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。DEPC 与氨水溶液混合会产生致癌物,因而使用时需小心。试验所用试剂也可用 DEPC 处理,加入DEPC 至 0.1%浓度,然后剧烈振荡 10 分钟,再煮沸 15 分钟或高压灭菌以消除残存的 DEPC,否则 DEPC 也能和腺嘌呤作用而破坏 mRNA 活性。但 DEPC 能与胺和巯基反应,因而含 Tris 和 DTT 的试剂不能用 DEPC 处理。Tris 溶液可用 DEPC 处理的水配制然后高压灭菌。配制的溶液如不能高压灭菌,可用 DEPC 处理水配制,并尽可能用未曾开封的试剂。除 DEPC 外,也可用异硫氰酸胍、钒氧核苷酸复合物、RNA 酶抑制蛋白等。此外,为了避免 mRNA 或 cDNA 吸附在玻璃或塑料器皿管壁上,所有器皿一律需经硅烷化处理。 细胞内总 RNA 制备方法很多,如异硫氰酸胍热苯酚法等。许多公司有现成的总 RNA 提取试剂盒,可快速有效地提取到高质量的总 RNA。分离的总 RNA 可利用 mRNA...
VIP
