目录 第一章 样品制备 2 1.1 一般性原则 2 1.2 样品制备程序 3 1.2.1 培养细胞样品处理方法 3 1.2.2 组织样品处理方法 3 1.2.3 文献报道较多的裂解液配方 4 第二章 第一向等电聚焦（IEF） 7 2.1 IPG 胶条的水化和电泳 7 2.1.1 仪器 7 2.1.2 试剂 7 2.1.3 实验步骤 7 2.2 IPG 胶条的平衡 9 2.2.1 仪器 10 2.2.2 试剂 10 2.2.3 实验步骤 10 第三章 第二向S DS 电泳 12 3.1 垂直 SDS-PAGE 12 3.1.1 溶液 12 3.1.2 灌胶步骤 12 3.1.3 电泳步骤 14 第四章 2-DE 胶蛋白质点的检测 15 4.1 考马斯亮兰染色 15 4.1.1 经典的考马斯亮兰染色程序 15 4.1.2 Neu h o ff 胶体考染法 15 4 .1 .3 热考马斯亮兰染色及二次染色法 16 4 .2 硝酸银染色 16 Appendix I Troubleshooting 18 Appendix II Solutions 23 2DE 分析流程： 样品制备（Sample preparation） 固相 pH 梯度胶条的水化（IPG strip rehydration） 第一向等电聚焦（IEF） 第一向胶条的平衡（ IPG strip equilibration） 1 第二向SDS 电泳（SDS-PAGE） 检测染色（Detection/Staining） 第一章 样品制备（Sample Preparation） 1 .1 一般性原则： 样品制备是双向电泳中最为关键的一步，这一步处理的好坏将直接影响2-DE 结果。目前并没有一个通用的制备方法，尽管处理方法是多种多样，但都遵循几个基本的原则：1）尽可能的提高样品蛋白的溶解度，抽提最大量的总蛋白，减少蛋白质的损失；2）减少对蛋白质的人为修饰；3）破坏蛋白质与其他生物大分子的相互作用，并使蛋白质处于完全变性状态。 根据这一原则，样品制备需要四种主要的试剂：离液剂(chaotropes),主要包括尿素（Urea）和硫脲（thiou rea）；表面活性剂（su factants）， 2也称去垢剂，早期常使用NP-40、TritonX-100 等非离子去垢剂，近几年较多的改用如 CHAPS 与 Zwittergent 系列等双性离子去垢剂；还原剂（reducing agents ），最常用的是二硫苏糖醇（DTT），也有用二硫赤藓糖醇（DTE）以及磷酸三丁酯（TBP）等。当然，也可以选择性的加入Tris-base, 蛋 白 酶 抑 制 剂（ 如 EDTA 、 PMSF or Protease inhibitor cocktails）以及核酸酶。 样品的来源不同，其裂解的缓冲液也各不相同。通过不同试剂的合理组合，以达到对样品蛋白的最大抽提。在对样品蛋白质提取的过程中，必须考虑到...
VIP
