基因的克隆与表达 基 因 基因(gene)这个名词是1909 年由遗传学家约翰森(W.L.Johannsen,1857—1927)提出来的.他用基因这一名词来表示遗传的独立单位,相当于孟德尔在豌豆试验中提出的遗传因子.顾名思义,基因不仅是一个遗传物质在上下代之间传递的基本单位,也是一个功能上的独立单位. 基因是DNA 分子上具有遗传效应的特定核苷酸序列的总称,是具有遗传效应的DNA(脱氧核糖核酸)分子片段.基因不仅可以通过复制把遗传信息传递给下一代,还可以使遗传信息得到表达,反映在蛋白质的分子结构上,从而使后代表现出与亲代相似的性状. 1.结构基因(structural gene)是指某些能决定某种多肽链(蛋白质)或酶分子结构的基因.结构基因的突变可导致特定蛋白质(或酶)一级结构的改变或影响蛋白质(或酶)量的改变. 2. 调控基因(regulator and control gene)是指某些可调节控制结构基因表达的基因.调控基因的突变可以影响一个或多个结构基因的功能,或导致一个或多个蛋白质(或酶)的改变. 简言之,基因就是编码一段功能蛋白质的DNA 序列及其调控序列. 克隆是英文(clon)clone 的音译 :指通过无性繁殖过程所产生的与亲代完全相同的子代群体. 无性繁殖是指不经过雌雄两性生殖细胞的结合,只由一个生物体产生后代的生殖方式,常见的有孢子生殖,出芽生殖和分裂生殖.由植物的根,茎,叶等经过压条或嫁接等方式产生新个体也叫无性繁殖. 克隆就是一种以 DNA 重组技术为基础的人工诱导的无性繁殖方式. 也称为分子克隆(molecular cloning)或基因克隆. DNA 重组技术是在分子水平对基因进行体外操作. 克 隆 分,切,接,转,筛 分,切,接,转,筛 分:目的基因的获得 1,PCR(RT-PCR) 2,酶切 PCR 技术 PCR:聚合酶链式反应 ( Polymerase Chain Reaction),是指利用耐热 DNA 聚合酶的反复作用,通过变性-复性-延伸的循环操作,在体外迅速将 DNA 模板扩增数百万倍的一种操作技术. 一,PCR 基本原理: 变性-复性-延伸 1.变性:通常采用加热变性,即将模板 DNA 或延伸后的双链 DNA 加热到 940C,使双螺旋 DNA 解开成为单链. 2.复性:通过降低反应温度至 500C- 650C ,使两种引物能与两条解开的DNA 互补链的3`端粘合,以提供 DNA 聚合酶催化聚合所需的3`-OH. 3.延伸:将反应温度提高到约720C,在耐热 DNA 聚合酶的催化下,根据模板 DNA 提供的碱基顺序,合成两条互补链,从而使模板 DNA 扩增一倍. PCR 技术特点 1,高度的敏感性. 2,高度的特异性. 3,操作...
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