一 目的基因的获得 细菌基因组DNA的提取 （一）仪器 1）台式高速离心机 2）恒温水浴箱 3）枪式移液器 4）灭菌的EP管和Tip头 （二）试剂 1）溶液1: 25% 蔗糖 50mmol/L Tris-Hcl，pH8.0 50mmol/L EDTA，pH8.0 500ug/ml 溶菌酶（现用现配） 100ug/ml RNase 2)溶液Ⅱ：100mmol/L Tris-Hcl，pH8.0 1% SDS 400ug/ml 蛋白酶K 3）酚：氯仿：异戊醇（25：24：1） 4）氯仿：异戊醇（24：1） 5）3mol/L NaAc(pH5.2) 6）异丙醇或无水乙醇 7）70%乙醇 8) TE缓冲液： 10mmol/L Tris-Hcl，pH8.0 1mmol/L EDTA，pH8.0 (三)实验步骤 1) 5mL细菌过夜培养，5000rpm离心10分钟，去上清液。 2）将菌体细胞悬于250uL溶液1中，37°C水浴保温过夜。 3）加250uL溶液Ⅱ，55°C水浴保温4小时。 4）加0.9倍体积的酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），轻轻混匀，于14000rpm离心10分钟，转移水相至新的Ep管，重复步骤4一次。 5）向转移的水相中加入0,9倍体积的氯仿/异戊醇（24：1），轻轻混匀，于14000rpm离心10分钟，转移水相至新的Ep管，重复步骤5一次。 6）向转移的水相中加入0.1倍体积的3mol/L NaAc和0.7倍体积的异丙醇（或2.5倍体积的无水乙醇），冰上放置30分钟。 7）14000rpm离心20分钟，弃上清，用0.5mL70%乙醇洗涤沉淀一次，弃上清，沉淀于室温干燥。 8）将DNA沉淀溶解于15ul TE缓冲液中，-20°C保存。 9）进行DNA含量和纯度检测，琼脂糖凝胶电泳鉴定。 植物DNA的SDS提取法： （一）试验试剂： 1）研磨缓冲液：称取59.63gNaCl，13.25g柠檬酸三钠，37.2gEDTA－Na分别溶解后合并为一，用0.2mol/L的NaOH 调至pH7.0，并定容至1000ml。 2）10 SSC溶液：称取87.66gNaCl 和44.12g柠檬酸三钠，分别溶解，一起定容至1000ml。 3）1 SSC溶液：用10 SSC溶液稀释10倍。 4）0.1 SSC溶液：用1 SSC溶液稀释10倍。 5）Rnase溶液：用0.14mol/LNaCl 溶液配制成25mg/ml 的酶液，用1mol/LHCl，pH至5.0，使用前经80℃水浴处理5min（以破坏可能存在的Dnase）。 6）氯仿－异戊醇：按24ml 氯仿和1ml 异戊醇混合。 7）5mol/L高氯酸钠溶液：称取NaClO4．H2O 70.23g，先加入少量蒸馏水溶解再容至100ml。 8) SDS（十二烷基硫酸钠）化学试剂的重结晶：将SDS放入无水酒精中达到饱和为止，然后在70～80℃的水浴中溶解，趁热过滤，冷却之后即将滤液放入冰箱，待 结晶出 现 再置室温下 凉 干待 用。 9) 1mol／ LHCl。 10) 0...
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