冷冻电子显微镜技术 冷冻电子显微镜技术在20 世纪70 年代时提出，经过近10 年的努力，在80 年代趋于成熟，近年来已经进入了快速发展的时期。它的研究对象非常广泛，包括病毒、蛋白、肌丝、蛋白质核苷酸复合体、亚细胞器等。一方面，冷冻电微镜技术所研究的生物样品既可以是具有二维晶体结构的，也可以是非晶体的；而且对于样品的分子量没有限制。因此，大大突破了 X -射线晶体学只能研究三维晶体样品和核磁共振波谱学只能研究小分子量（小于 100K D ）样品的限制。另一方面，生物样品是通过快速冷冻的方法进行固定的，克了因化服学固定、染色、金属镀膜等过程对样品构象的影响，更加接近样品的生活状态。 冷冻电子显微学解析生物大分子及细胞结构的核心是透射电子显微镜成像,包括样品制备、图像采集、图像处理及三维重构等几个基本步骤。 一、样品制备 用于冷冻电镜研究的生物样品必须非常纯净。生物样品是在高真空的条件下成像的，所以样品的制备既要能够保持本身的结构，又能抗脱水、电子辐射。现在普遍采用的方法是通过快速冷冻使含水样品中的水处于玻璃态，也就是在亲水的支持膜上将含水样品包埋在一层较样品略高的薄冰内。冰的结构多种多样，包括六角形冰、立方体冰等，其物理状态与冷冻速率有关。若要形成玻璃态（即无定形态）的冰，需要冷冻速率达到每秒钟104 摄氏度。此时，冰的结构呈现各向同性，不会因成像角度不同而导致图像产生偏差。该方法有两个步骤：一是将样品在载网上形成一薄层水膜；二是将第一步获得的含水薄膜样品快速冷冻。在多数情况下，用手工将载网迅速浸入液氮内可使水冷冻成为玻璃态。其优点在于将样品保持在接近生活状态，不会因脱水而变形，同时可以减少辐射损伤。 二、图像采集 冷冻的样品通过专门的设备——冷冻输送器转移到电镜的样品室。在照相之前，必须观察样品中的水是否处于玻璃态，如果不是则应重新制备样品。由于生物样品对高能电子的辐射敏感，照相时必须使用最小曝光技术。经过透射电子显微镜中一系列复杂的过程，最终在记录介质上会形成样品放大几千倍至几十万倍的图像。利用计算机对这些放大的图像进行处理分析即可获得样品的精细结构。近年来，一个技术上的重大突破是高分辨率图像采集设备的开发与应用。基于互补金属氧化物半导体(CMOS)技术开发的直接探测电子成像的装置使电子显微放大图像的信噪比相对过去所使用的底片或电荷耦合元件(CCD)有了很大提高, 进而提高了成像的质量。 三...
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