1 动物血中超氧化物歧化酶的提取与纯化 一、超氧化物歧化酶的提取 [原理] l969 年，McCord 和 Fridov ich 第一次从牛血中提纯到超氧化物岐化酶。自然界中SOD 分布极广，其含量随生物体的不同而不同，即使同一种生物的不同组织或同一组织的不同部位，其 SOD 的种类和含量也有很大差别。迄今为止人们已从细菌，真菌、原生动物。藻类、昆虫、鱼类、植物和动物等各种生物体内分离得到 SOD。为拓宽提取 SOD的原料，筛选或基因过程开发产 SOD 量较高的菌株。目前，研究开发最多的资源还是从动物血液、动物组织中制备提纯 SOD。 从动物血液材料中制备 Cu Zn-SOD 纯化工艺分为三个主要步骤： （1）原材料的预处理； （2）粗酶液的制备； （3）离子交换柱层析精制。 国内多采用 Mccord 和 Fridov ich 法，其主要工艺过程为： 第一步，乙醇-氯仿除去血红蛋白； 第二步，有机溶剂和硫酸铵分级沉淀； 第三步，离子交换柱层析精制。 [试剂和器材] 1、试剂 3.8%（质量分数）柠檬酸三钠；0.9%（质量分数）氯化钠 ；95%（体积分数）乙醇；氯仿；丙酮 ；pH7.6、2.5mmol/L K2HPO4-KH2PO4 缓冲液 ；DEAE-Sephadex A-50 2、器材 猪血；恒温水浴 ；离心机 ；布氏漏斗；抽滤瓶；烧杯、量筒、搅棒等；透析袋 [方法和步骤] 1、从猪血中提取 SOD （1）分离血球 取新鲜猪血，加入到 3.8%柠檬酸三钠抗凝液中，新鲜猪血与抗凝液的比例为 3：1，轻轻搅拌均匀，4 000r/min 离心 20min，收集红血球。 （2）除血红蛋白 红血球用 3 倍体积生理盐水洗涤，4 000r/min 离心 20min，重复三次，然后向洗净的红血球加入 1～1.1 倍体积去离子水，搅拌溶血 30min，再向溶血液中分别缓慢加入 0.25倍体积的预冷 95%乙醇和 0.15 倍体积的预冷氯仿，剧烈搅拌 15min 左右，静置 1h，然后 4 000r/min 离心 20min 除去变性血红蛋白沉淀，取清液，过滤，收集滤液（记录体积，测酶活性和蛋白浓度）。 2 （3）热变性 上清液加热到 65℃，保温 10min，然后迅速冷却到室温，3 000r/min 离心 20min，弃去沉淀物，收集上清液（记录体积，测酶活性和蛋白浓度）。 （4）沉淀 清液在盐冰浴中冷却，然后在-5℃以下的操作温度下，加入 1.5 倍量预冷丙酮，边加边搅拌均匀，即有白色沉淀产生，静置 2～3min，迅速抽滤，弃去滤液得肉色沉淀。沉淀物用少量蒸馏水溶解，4 000r/min 离心 20min，除去不溶物，用 pH7.6...
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