蛋白质亚基分子量测定 SDS-PAGE 凝胶电泳 一 目的 掌握 SDS-PAGE 凝胶电泳测定蛋白质亚基分子量的基本原理和操作方法 二 原理 SDS 是一种阴离子去污剂，作为变性剂和助溶性试剂，能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级、三级结构；而强还原剂，如二硫苏糖醇、β -巯基乙醇能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。 因此，在样品和凝胶中加入 SDS 和还原剂后，蛋白质分子被解聚为组成它们的多肽链，解聚后的氨基酸侧链与 SDS 结合后，形成带负电的蛋白质-SDS 胶束，所带电荷远远超过了蛋白质原有的电荷量，消除了不同分子间的电荷差异；同时，蛋白质-SDS 聚合体的形状也基本相同，这就消除了在电泳过程中分子形状对迁移率的影响。 基于上述SDS-PAGE 的原理介绍，我们可以利用SDS-PAGE 电泳进行未知蛋白质的分子量测定；以不同分子量的标准蛋白进行SDS-PAGE 电泳得到不同标准蛋白的电泳迁移率，制作标准校正曲线，然后对未知蛋白在相同条件下进行SDS-PAGE 电泳，测定迁移率，从标准曲线得到相应的分子量 三 试剂和器材 试剂：1 低分子量标准蛋白质 2 待测蛋白质样品（用上次测定的可溶性蛋白样液） 3 凝胶贮液：30g 丙烯酰胺，0.8g 甲叉双丙烯酰胺，溶于100ml 蒸馏水中，过滤，于4°暗处贮存，一个月内使用 4 1mol/l，PH8.8 Tris-HCl 缓冲液，Tris121g 溶于蒸馏水，用浓盐酸调至 PH8.8，以蒸馏水定容至 1000ml 5 10%(w /v)SDS 6 10%(w /v)过硫酸铵溶液（当天配） 7 四甲基乙二胺（TEMED） 8 电极缓冲液PH8.3：Tris30.3g，甘氨酸 144.2g，SDS 10g， 溶于蒸馏水并定容至 1000ml,使用时稀释 10 倍。 9 2×样品稀释液： SDS 500mg,巯基乙醇 1ml ,甘油 3ml, 溴酚蓝 4mg，1mol/L Tris-HCL (pH6.8)，用蒸馏水溶解并定容至 10ml，按每份 1ml 分装，可在 4℃存放数周，或在-20℃保存数月。以此液制备样品时，样品若为液体，则加入与阳平等体积的原液混合即可。 10 固定液：500ml 乙醇，100ml 冰醋酸，用蒸馏水定容至 1000ml 11 脱色液：250ml 乙醇，80ml 冰醋酸，用蒸馏水定容至 1000ml 12 染色液： 0.29g 考马斯亮蓝 R-250 溶解在 250ml 脱色液中 器材：微量进样针，电泳仪，电泳槽 四 操作步骤 1 分离胶制备： 凝胶浓度 5% 7.5% 10% 12.5% 15% 凝胶贮液ml 5 7.5 10 12.5 15 1mol/LPH8.8 Tris-HClml 11.2 11.2 11.2...
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