- 1 - 实验十一 植物原生质体的分离及融合（理论） 原生质体培养的主要目的是实现远缘物种的体细胞杂交，外源染色体、D N A 或细胞器的导入，创造新的远缘杂种。全部技术环节包括原生质体分离、原生质体培养、体细胞杂交、杂种细胞产生愈伤组织及再生植株等。 一、原生质体的概念 1、原生质体 是指用特殊方法脱去植物细胞壁的、裸露的、有生活力的原生质团。没有细胞壁，但具有活细胞的一切特征。 2、原生质体培养 指将植物细胞游离成原生质体，在适宜的培养条件下，依据细胞的全能性使其再生细胞壁，进行细胞的分裂分化，并发育成完整植株的过程。 二、原生质体的分离方法 1、机械分离法 - 2 - 采用渗透方法使细胞发生质壁分离，然后切开细胞壁释放出原生质体。特点是原生质体产量很低；方法繁琐费力；局限性大。 2、酶法分离 采用果胶酶、纤维素酶等酶类对植物细胞壁进行酶解，得到原生质体。 三、原生质体纯化与活力测定 1、原生质体的纯化 a、离心沉淀法 应用原生质体的比重大于溶液的性质，将原生质体沉于底部，收集原生质体备用。 b、漂浮法 应用渗透剂含量较高的洗涤液使原生质体漂浮于液体表面。依次通过网筛过滤、离心、收集沉淀，再用蔗糖液洗涤离心 2—3 次，漂浮收集即可。 c、界面法 - 3 - 选用两种不同渗透浓度的溶液，一种溶液密度大于原生质体的密度，另一种小于原生质体的密度，进行界面收集原生质体。 2、活力测定 a、形态识别 形态上完整，含有饱满的细胞质，颜色新鲜的即为存活的原生质体。 b、染色识别 用0.1%酚番红或伊凡蓝进行染色，后进行观察，有活力而质膜完整的原生质体对染料有排斥作用而不被染色，死亡的却被染上颜色。 四、原生质体的培养方法 培养方法有四种，即固体薄层培养法、液体浅层培养法、双层培养法和琼脂糖珠培养法。 1、固体薄层培养法 又叫平板培养法，指将一定体积的原生质体按照一定细胞密度与等体积的处于45℃的琼脂培养基混合，在培养皿内制成薄层固体平板的方法。使原生质体位置固定，避免其游动，便于定点观察。 2、液体浅层培养法 - 4 - 是将原生质体用培养液调整到一定细胞密度，取出3—4m l 置于培养皿中浅层静止培养的方法。 3、双层培养法 又分为液体-固体双层培养法和固体-固体双层培养法。将一定浓度原生质体悬浮液涂布在固体琼脂培养基表面的培养方法为液体-固体双层培养法。是液体培养与固体培养的结合，既利于原生质体的生长，又...
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