RNA 提取常见问题 点击次数：276 发布时间：2011-5-30 1、 RNA 降解 A、新鲜细胞：如果试剂没有问题，且外源性污染也可以排除，那么降解几乎都来自裂解液的用量不足。如果将裂解液直接加入培养皿中裂解细胞，一定要使裂解液能覆盖住细胞。 B、新鲜组织：某些富含内源核酸酶的样品(如肝脏，胸腺等)，即使使用电动匀浆器匀浆也不能避免RNA 的降解。更可靠的方法是：在液氮条件下将组织研碎，并且匀浆时使用更多裂解液。 C、冷冻样品：样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后移至-70℃冰箱保存。样品决不能未经液氮速冻而直接保存于-70℃冰箱中。冷冻样品，即使是冷冻细胞，如果不在液氮条件下研磨碎，而直接加入裂解液中匀浆，RNA 也比新鲜样品更容易降解。样品在与裂解液充分接触前决不能出现融化，所以研磨用具必须预冷，在碾磨过程中要及时补充液氮。样品研碎后，在液氮刚刚挥发完时，将样品迅速转移到含裂解液的容器中，立即混匀匀浆。 D、外源RNA 酶的污染：试剂，器械及实验环境中的RNA 酶进入实验系统。 E、 内源RNA 酶的污染：抑制剂失效或者用量不够，实验样品过多；匀浆时温度过高。 2、 OD260/280 比值偏低 A、蛋白质残留 使用酚氯仿抽提，去除残留的蛋白质(但经此步骤操作，约损失40%的 RNA)。 B、盐分残留 加入2.5 倍体积的无水乙醇和终浓度是0.1M 的 NaCl 沉淀RNA， -20℃放置30 分钟充分沉淀RNA，然后4℃下10,000×g 离心15 分钟收集沉淀，溶于DEPC 处理过的水中。 C、设备限制 测定OD260 及 OD280 数值时，使 OD260 读数在0.1-0.5 之间。此范围线性最好。用水稀释样品：测OD 值时，对照及样品稀释液请使用10mM Tris， pH7.5。用水作为稀释液将导致比值偏低。 3、 RNA 提取得率低 A、 使用样品过多，超过吸附柱的最大结合量 使用过多的样品，将会导致RNA 的降解。 B、 Wash Buffer 中未加入无水乙醇 使用前，需在DNA Wash Buffer 和 DNAse I Stop Buffer 中加入无水乙醇。 C、洗脱不正确 加入洗脱Buffer 后，放置2~3 分钟在进行离心洗脱。 D、处理样品太多 减少处理样品的量。 E、样品中RNA 本身含量低 增加样品用量和裂解液用量。 F、电泳检测时，换用新的电泳缓冲液，并尽量减少电泳时间。 4、基因组污染 A、 RT-PCR 反应中，使用过量的RNA 减少RT-PCR 反应中RNA 模板的量至50~100 ng。 B、使用过多的组织 使用过多的组织将会导致大量基因组D...
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