RNA 干扰技术的原理与应用 RNA 干扰( RNAinterference , RNAi )是通过小干扰 RNA ( small interference RNA, siRNA ) 造成目的mRNA 特异性降解, 从而使基因转录后沉默的一种现象。这一现象广泛存在于自然界, 是生物体进化过程中抵御外来基因侵害的一种机制, 为稳定基因组发挥了重要作用。由于 RNAi 可以作为一种简单、 有效的代替基因剔除的遗传工具,正在功能基因组学领域掀起一场真正的革命, 并将加快这个领域的研究步伐。 1 RNAi 现象的发现及发展 1995 年, Guo 等用反义 RNA 阻断秀丽新小杆线虫的 part 1 基因的实验中发现, 正义和反义 RNA 都阻断了该基因的表达,这与传统上对反义 RNA 技术的解释相反。1998 年 2 月卡耐基研究院的 F i re等将双链 RNA ( double stranded RNA, ds RNA)转入细胞内,发现靶基因的 mRNA 发生了降解,证实高度纯化的 ds RNA 可以高效特异的阻断相应的基因表达,而且效率比单链 RNA 至少高 2 个数量级,首次揭示了 Guo 等遇到的现象,即为 RNAi。 随后研究发现, RNAi 现象广泛存在于各种生物中,是一种古老的重要保护机制, RNAi 技术作为一种重要的研究手段大大加速了基因组学的研究进程,现已成为基因功能研究和基因治疗研究的热点。 在短短几年中,对 RNAi 的研究取得了突飞猛进的发展, 许多令人振奋的报道相继出现, 2001 年首次报道了在哺乳动物细胞培养中成功应用 RNAi 技术抑制基因表达, 开创了 RNAi 技术应用于高等生物基因功能研究的先河; 2002 年, K ay 研究小组首次报道了应用 RNAi技术在哺乳动物整体水平进行基因表达沉默的实验研究;2004 年哺乳动物全基因组范围 RNAi 研究也取得了重要进展,先后报道了用酶法构建全基因组 siRNA 文库新技术和应用基因组 siRNA 文库,从全基因组水平对高等动物基因功能进行高通量 RNAi 研究。这些研究成果愈来愈表明, 生物体基因转化的最终产物不仅仅是蛋白质,还包括相当一部分 RNA。 2 RNAi 的作用机制 细胞中 ds RNA 的存在是 RNAi 形成的先决条件。ds RNA 可以通过多种途径在细胞核或细胞质中产生。通过对 RNAi 所进行的遗传学和生物化学的研究,现已初步阐明了其作用机制。RNAi 的作用机制可分为三个阶段:起始阶段、 效应阶段和级联放大阶段。 起始阶段:由 RNA 病毒入侵,转座子转录,基因组中反向重复序列转录等所产生的 ds RNA 分子...
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