PCR 扩增的原理和操作步骤[资料] PCR 扩增反应的操作 第一节 PCR 扩增反应的基本原理 一、聚合酶链式反应(PCR)的基本构成 PCR 是聚合酶链式反应的简称，指在引物指导下由酶催化的对特定模板(克隆或基因组DNA)的扩增反应，是模拟体内DNA 复制过程，在体外特异性扩增DNA 片段的一种技术，在分子生物学中有广泛的应用，包括用于DNA 作图、DNA 测序、分子系统遗传学等。 PCR 基本原理: 是以单链DNA 为模板，4 种dNTP 为底物，在模板3’末端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板DNA 得到极大程度的扩增。在微量离心管中，加入与待扩增的DNA 片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的 2+DNA 膜板、四种dNTP 溶液、耐热Taq DNA 聚合酶、Mg 等。反应时先将上述溶液加热，使模板DNA 在高温下变性，双链解开为单链状态;然后降低溶液温度，使合成引物在低温下与其靶序列配对，形成部分双链，称为退火 ;再 将温度升 至 合适温度，在Taq DNA 聚合酶的催化下，以dNTP 为原料，引物沿 5’?3’方 向 延伸，形成新 的DNA 片段，该 片段又 可 作为下一轮 反应的模板，如 此 重 复改 变温度，由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周 期 ，反复循环，使目 的基因得以迅 速扩增。因此 PCR 循环过程为三 部分构成:模板变性、引物退火 、热稳 定DNA 聚合酶在适当 温度下催化DNA 链延伸合成(见 图)。 1(模板DNA 的变性 模板DNA 加热到 90~95?时，双螺 旋 结 构的氢 键 断 裂 ，双链解开成为单链，称为DNA 的变 G-C 间 由 三 个 性 ， 以 便 它 与 引 物 结 合 ， 为 下 轮 反 应 作 准 备 。 变 性 温 度 与 DNA 中G-C 含 量 有 关 ， 氢 键 连 接 ， 而 A-T 间 只 有 两 个 氢 键 相 连 ， 所 以 G-C 含 量 较 高 的 模板 ， 其 解 链 温 度 相 对 要 高 些 。 故 PCR 中 DNA 变 性 需 要 的 温 度 和 时 间 与 模 板 DNA 的 二级 结 构 的 复 杂 性 、 G-C 含 量 高 低 等 均 有 关 。 对 于 高 G-C 含 量 的 模 板 DNA 在 实 验 中 需添 加 一 定 量 二 甲 基 亚 砜 (DMSO)， 并 且 在 PCR 循 环 中 起 始 阶 段 热 变 性 温 度 可 以 采 用97?， 时 间 适 当...
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