PCR基本原理及注意事项目录目录基本原理基本原理常见问题常见问题反应体系反应体系基本原理：基本原理：变性延伸退火模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链反应体系反应体系10×10×扩增缓冲液扩增缓冲液4种dNTP混合物引物模板DNATaqDNA聚合酶Mg2加双或三蒸水至10ul200umol/L各10～100pmol0.1～2ug2.5u1.5mmol/L100ul引物酶dNTP模板Mg2五要素PCR反应有或能加上合适的酶切位点有或能加上合适的酶切位点与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性引物引物3’3’端的碱基严格配对端的碱基严格配对特别是最末及倒数第二个碱基特别是最末及倒数第二个碱基GCGC含量以含量以40-60%40-60%为宜为宜ATGC随机分布避免引物内部出现二级结构避免引物内部出现二级结构避免两条引物间互补避免两条引物间互补扩增跨度扩增跨度以以200-500bp200-500bp为宜为宜15-30bp15-30bp引物引物设计设计酶及其浓度酶及其浓度酶及其浓度酶及其浓度栖热水生杆菌栖热水生杆菌天然酶天然酶大肠菌合成基因大肠菌合成基因工程酶工程酶催化一典型的催化一典型的PCRPCR反应约需酶量反应约需酶量2.5U(2.5U(指总反应体积为指总反应体积为100ul100ul时时))催化一典型的催化一典型的PCRPCR反应约需酶量反应约需酶量2.5U(2.5U(指总反应体积为指总反应体积为100ul100ul时时))dNTP呈颗粒状，-20°C保存1MNaOH或1MTris.HCL将PH调节到7.0～7.5dNTP质量与浓度反应中，dNTP应为50～200umol/L小量分装-20℃冰冻保存模板核酸DNA纯化RNA纯化蛋白酶KSDS溶解细胞膜解离核蛋白与蛋白结合成沉淀水解消化蛋白质（组蛋白）异硫氰酸胍或蛋白酶K法Mg2浓度dNTP浓度为200umol/L时，Mg2浓度为1.5～2.0mmol/L为宜浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增常见问题假阳性出现片状拖带或涂抹带出现非特异性扩增带选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性假阳性引物设计不合适靶序列或扩增产物的交叉污染空气中的小片段核酸污染整个基因组或大片段的交叉污染靶序列太短或引物太短污染解决方法污染解决方法操作时应小心轻柔紫外照射耗材一次性使用高压消毒巢式PCRMg2+离子浓度过高退火温度过低PCR循环次数过多引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体酶的质和量出现非特异性扩增带解决方法减低酶量或调换另一来源的酶适当提高退火温度或用二温度点法重新设计引物降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数dNTP浓度过高出现片状拖带或涂抹带Mg2+浓度过高退火温度过低酶量过多或酶的质量差循环次数过多：2011祝愿大家新年快乐兔年吉祥，合家幸福，万事如意！，
