讨论 1.假阴性,不出现扩增条带 PCR 反应的关键环节有①模板核酸的制备,②引物的质量与特异性,③酶的质量,④PCR 循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 模板:①模板中含有Taq 酶抑制剂,②在提取制备模板时丢失过多,或吸入酚。③模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时,不出现扩增带,有可能是模板核酸提取过程出了毛病,可使用阳性对照的DNA 模板配合检查模板质量。 酶失活:需更换新酶,或新旧两种酶同时使用,以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。 引物:引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称,是 PCR 失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题,两条引物一条浓度高,一条浓度低,造成低效率的不对称扩增,对策为:①选定一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看 OD 值,更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳,一定要有引物条带出现,而且两引物带的亮度应大体一致,如一条引物有条带,一条引物无条带,此时做 PCR 有可能失败,应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高,一条亮度低,在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存,防止多次冻融或长期放冰箱冷藏,导致引物变质降解失效。④引物设计不合理,如引物长度不够,引物之间形成二聚体等。 Mg2+浓度:Mg2+离子浓度对 PCR 扩增效率影响很大,浓度过高可降低 PCR 扩增的特异性,浓度过低则影响 PCR 扩增产量甚至使 PCR 扩增失败而不出扩增条带。 反应体积的改变:通常进行 PCR 扩增采用的体积为 20u l、30u l、50u l、或 100u l,应用多大体积进行 PCR 扩增,是根据科研和临床检测不同目的而设定,在做小体积如 20u l 后,再做大体积时,一定要模索条件,否则容易失败。 物理原因:变性对 PCR 扩增来说相当重要,如变性温度低,变性时间短,极有可能出现假阴性;退火温度过低,可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率,退火温度过高影响引物与模板的结合而降低 PCR 扩增效率。有时还有必要用标准的温度计,检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度,这也是 PCR 失败的原因之一。 靶序列变异:如靶序列发生突变或缺失,影响引物与模板特异性结合,或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列,其 PCR 扩增是不会成功的。 2.假阳性 出现的 PCR 扩增条带与目的靶序列条带一致,有时其条带更整齐,亮度更高。 引物设计不合适:选择的扩增序...