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PCR 扩 增 失 败 的 原 因 分析 2010-12-13 16:48:31| 分类: 默认分类|字号 订阅 PCR 扩增失败原因分析,PCR 产物电泳 2010-05-15 16:07 一 模板质量问题: 1)模板提取不完整,其中不含你的目的基因,或目的基因含量太低。可以跑个电泳看看提取的DNA,PCR 阳性样品与阴性样品是否有明显差别。如果确定是这种问题,可以增加模板量试试,但不一定行得通。 2)模板里面残留某种试剂成份,可能抑制 Taq 聚合酶的活性,如果是这种情况,可以用试剂盒把模板再纯化一下,或将模板做个梯度稀释以确定最佳的模板量。 3) 为什么跑电泳会出现拖带呢? 1. 有可能的因为你的电压调的太高了。电泳跟很多因素有关,其中就有一个是电压,在适当的电压范围内增加是可以加快迁移速率,但是要是超到一个临界值反而有害。你可以适当的调低点看看。 2.有时候发现上样量太多的话会有拖带。你看能否回收之后 ,按1:50 或1:100 等稀释后,再当成模板扩一次怎 么样。 二 引 物问题 1)样品自 身 的基因型 差异 导 致 扩增失败。也 就是说 你的引 物与某些基因型 的样品结 合的好 ,而和 另 一些 基因型 结 合不好 。可以换 一对 更 保 守 的引 物试试。祝 顺 利 ! 2)普 通 PCR 所 用的一对 引 物中有一个引 物加多了,为正 常 的三 倍只 要引 物特 异 性比 较 好 ,那 么不会产生 大 的影 响 。如果恰 巧 是加多的这条 引 物不是很特 异 的话,也 许 会扩出来 非 特 异 带。 在制备 单 链 探 针 时候就采 取这样的不对 称 pcr,没 关系 的 三 Taq 酶处 于 失活状 态 。因为活性降 低了能出现二 聚体 。 tap 酶种类 高特 异 性 Taq 酶 高度特 异 性地 扩增所 需 的片 段 是 PCR 最基本 的要求 ,影 响 PCR 特 异 性的因素很多,包括模板、引物性质及质量、反应条件的控制等等,而高特异性 Taq酶的出现大大减少了摸条件这一繁琐的实验过程,也为 PCR 产物快速有效的纯化(PCR 产物直接纯化)打下了基础。这类酶最典型的代表是热启动 Taq 酶。大家都知道,在 PCR 第一个循环变性之前,有一个升温的过程,引物和模板会有一些非特异性配对,如果这时 Taq 酶发挥活性,就很容易产生非特异性扩增,由于循环初期模板量非常少,产生的非特异性条带经过后面的指数扩增,就会严重干扰目的片段的扩增,甚至导致特异...

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