1 PCR 扩增反应的操作 第一节 PCR 扩增反应的基本原理 一 、 聚 合 酶 链 式 反 应 （ PCR） 的 基 本 构 成 PCR 是 聚 合 酶 链 式 反 应 的 简 称 ，指 在 引 物 指 导 下 由 酶 催 化 的 对 特 定 模 板 （ 克 隆 或 基 因 组 DNA）的 扩 增 反 应 ， 是 模 拟 体 内 DNA 复 制 过 程 ， 在 体 外 特 异 性 扩 增 DNA 片 段 的 一 种 技 术 ， 在 分 子 生 物学 中 有 广 泛 的 应 用 ， 包 括 用 于 DNA 作 图 、 DNA 测 序 、 分 子 系 统 遗 传 学 等 。 PCR 基 本 原 理 是 以 单 链 DNA 为 模 板 ， 4 种 dNTP 为 底 物 ， 在 模 板 3’末 端 有 引 物 存 在 的 情 况 下 ，用 酶 进 行 互 补 链 的 延 伸 ， 多 次 反 复 的 循 环 能 使 微 量 的 模 板 DNA 得 到 极 大 程 度 的 扩 增 。 在 微 量 离 心管 中 ， 加 入 与 待 扩 增 的 DNA 片 段 两 端 已 知 序 列 分 别 互 补 的 两 个 引 物 、 适 量 的 缓 冲 液 、 微 量 的 DNA膜 板 、 四 种 dNTP 溶 液 、 耐热Taq DNA 聚 合 酶 、 Mg2+等 。 反 应 时先将上述溶 液 加 热， 使 模 板 DNA在 高温下 变性 ， 双链 解开为 单 链 状态；然后降低溶 液 温度 ， 使 合 成 引 物 在 低温下 与 其靶序 列 配对 ，形成 部分 双链 ， 称 为 退火；再将温度 升至合 适 温度 ， 在 Taq DNA 聚 合 酶 的 催 化 下 ， 以 dNTP 为 原料， 引 物 沿5’→3’方向延 伸 ， 形成 新的 DNA 片 段 ， 该片 段 又可作 为 下 一 轮反 应 的 模 板 ， 如此重复改变温度 ， 由 高温变性 、 低温复 性 和适 温延 伸 组 成 一 个 周期， 反 复 循 环 ， 使 目的 基 因 得 以 迅速扩增 。 因 此PCR 循 环 过 程 为 三部分 构 成 ：模 板 变性 、 引 物 退火、 热稳定DNA 聚 合 酶 在 适 当温度 下催 化 DNA 链 延 伸 合 成 （ 见图 ）。 1．模 板 DNA 的 变性 模 板DNA 加 热到 90~95℃时， 双螺旋结构 的 氢键断裂， 双链 解开成 为 单 链 ， 称 为 DNA...
VIP
