第六章 第四节 生物化学方法及其在中医研究中的应用一．生物化学的主要实验方法有哪些？答题要点：（一）生物大分子物质的分离和提纯生物大分子主要指蛋白质、核酸、糖类和脂类等物质。制备高度纯化的生物大分子是研究大分子结构与功能的前提，整个分离提纯过程可分为以下几个阶段： 1．材料选择。原则是：选取所需成分含量较高、来源丰富、工艺简单、成本低廉的材料。例如，胰岛素的提取可选择猪胰。还要注意取材新鲜，要进行预处理，对于蛋白质和核酸的提取要在低温条件下进行，防止生物大分子的变性、失活。 2．细胞破碎。生物大分子绝大部分存在于细胞内。根据材料来源及实验要求，可选取匀浆器研磨、高速组织捣碎器、反复冻融、超声波破碎、自溶、酶消化、表面活性剂处理法等。 3．亚细胞器的分离。各类生物大分子在细胞内分布往往是区域化的。例，DNA 几乎全部在细胞核中，电子传递链和氧化磷酸化酶系分布在线粒体，蛋白质合成酶系在内质网（微粒体）上，Na+-K+-ATP 酶分布在细胞膜上等，因此细胞破碎后，可以先分离亚细胞器，这有助于制备纯度更高的生物大分子。亚细胞器的分离，一般采用不同密度梯度介质，经差速离心法制备。 4．提取。提取过程，首先要使生物大分子与其他物质分离开来，使大分子物质充分释放出来，在此过程中，特别要考虑溶剂性质、pH 值、离子强度、介电常数、抽提温度等多种影响溶解度的因素，然后可结合经验并根据具体实验条件灵活地选取某一试剂进行提取。 5．分离纯化。刚提取得到的大分子物质，往往是粗制品，含有许多杂质，必须进一步分离纯化。分离提纯各种生物大分子，主要根据各种物质的分子大小、溶解度、带电性、亲和力大小等差异，选用有机溶剂沉淀，等电点沉淀，盐析，层析，电泳，超离心，吸附，结晶等方法。 6．浓缩、干燥及保存。经过分离、纯化得到的提取液有时很稀，体积较大，需要采用蒸馏法、冰冻法、吸收法、超滤法等，去除水分而浓缩。最后低温保存，有时还需加入防腐剂或稳定剂，防止生物大分子变性失活。（二）离心技术离心技术是利用物体高速旋转时产生强大的离心力，使置于旋转体中的悬浮颗粒发生沉降或漂浮，从而使某些颗粒达到浓缩或与其他颗粒分离之目的。这里的悬浮颗粒往往是指制成悬浮状态的细胞、细胞器、病毒和生物大分子等。离心机转子高速旋转时，当悬浮颗粒密度大于周围介质密度时，颗粒离开轴心方向移动，发生沉降；如果颗粒密度低于周围介质的密度时，则颗粒朝向轴心...
VIP
