生物技术综合实验生物技术综合实验实验三实验三超氧化物歧化酶（超氧化物歧化酶（SODSOD）的提取及活性）的提取及活性测定测定一、目的和要求一、目的和要求通过植物材料（玉米）超氧化通过植物材料（玉米）超氧化物歧化酶（物歧化酶（SODSOD）的提取及活性测定，）的提取及活性测定，掌握硫酸铵盐析沉淀蛋白质及超滤浓缩蛋掌握硫酸铵盐析沉淀蛋白质及超滤浓缩蛋白质的方法和原理。白质的方法和原理。二、实验原理二、实验原理超氧化物歧化酶（超氧化物歧化酶（SODSOD）广泛存在于植物）广泛存在于植物体内，它是一种重要的自由基清除剂，对体内，它是一种重要的自由基清除剂，对生物体有多种保护作用。超滤是一种蛋白生物体有多种保护作用。超滤是一种蛋白质浓缩方法，只要选择适当的滤膜可将玉质浓缩方法，只要选择适当的滤膜可将玉米浆中的米浆中的SODSOD与其他小分子杂蛋白、可溶与其他小分子杂蛋白、可溶性糖等分离。性糖等分离。三、材料与试剂三、材料与试剂1.1.材料材料玉米籽粒玉米籽粒2.2.主要试剂主要试剂11、、0.05mol/L0.05mol/L磷酸缓冲液（磷酸缓冲液（pH7.8pH7.8））,500mL,500mL22、氯仿、氯仿--乙醇混合液：氯仿乙醇混合液：氯仿::无水乙醇无水乙醇=3:5=3:533、丙酮：用前需预冷至、丙酮：用前需预冷至4-10℃4-10℃44、、0.05mol/L0.05mol/L碳酸盐缓冲液（碳酸盐缓冲液（pH10.2pH10.2））55、、0.1mol/LEDTA0.1mol/LEDTA溶液溶液2.32.3仪器仪器恒温水浴锅、恒温水浴锅、冷冻高速离心机、冷冻高速离心机、可见分光光度计、可见分光光度计、研钵、玻棒、烧杯、量筒，等。研钵、玻棒、烧杯、量筒，等。四四、操作步骤、操作步骤4.1SOD4.1SOD粗提液的制备粗提液的制备11、组织细胞破碎：称取、组织细胞破碎：称取5g5g大蒜蒜瓣或玉大蒜蒜瓣或玉米种子，置于研钵中研磨。米种子，置于研钵中研磨。22、、SODSOD的提取：破碎后的组织中加入的提取：破碎后的组织中加入2-2-33倍体积的倍体积的0.05mol/L0.05mol/L磷酸缓冲液（磷酸缓冲液（pH7.pH7.88），继续研磨），继续研磨20min20min，使，使SODSOD充分溶解充分溶解到缓冲液中，然后在到缓冲液中，然后在5000rpm5000rpm下离心下离心15mi15minn，取上清液。，取上清液。33、除杂蛋白：上清液加入、除杂蛋白：上清液加入0.250.25体积的氯体积的氯仿仿--乙醇混合液搅拌乙醇混合液搅拌15min15min，，5000rpm5000rpm离离心心15min15min，得到的上清液为粗酶液。，得到的上清液为粗酶液。44、、SODSOD的沉淀分离：粗酶液中加入等体的沉淀分离：粗酶液中加入等体积的冷丙酮，搅拌积的冷丙酮，搅拌15min15min，，5000rpm5000rpm离心离心15min15min，得，得SODSOD沉淀。将沉淀。将SODSOD沉淀溶于沉淀溶于0.05mol/L0.05mol/L磷酸缓冲液（磷酸缓冲液（pH7.8pH7.8）中，于）中，于555-60℃5-60℃热处理热处理15min15min，得到，得到SODSOD酶液。酶液。3.2SOD3.2SOD活性测定活性测定试剂（试剂（mLmL）空白对照管样品）空白对照管样品管管碳酸缓冲液碳酸缓冲液5.05.05.05.0EDTAEDTA溶液溶液0.50.50.50.5蒸馏水蒸馏水0.50.5——样品液—样品液—0.50.5混合均匀，在混合均匀，在30℃30℃水浴中预热水浴中预热5min5min，测定，测定OD48OD48003.33.3结果计算结果计算总酶活力总酶活力==酶液总体积酶液总体积XX稀释倍数稀释倍数//抑制抑制50%50%的酶液量的酶液量XX样品重样品重五、本实验教学内容的重点和难点五、本实验教学内容的重点和难点重点：粗提液的获得玉米重点：粗提液的获得玉米SODSOD的提取的提取难点：提取条件的控制难点：提取条件的控制六、本实验教学内的深化和拓展六、本实验教学内的深化和拓展通过本实验的学习，使学生明确实验的意义，联通过本实验的学习，使学生明确实验的意义，联系实际，使学生了解本实验的应用。明确植物系实际，使学生了解本实验的应用。明确植物SSODOD与动物与动物SODSOD的区别，了解植物的区别，了解植物SODSOD的优势。的优势。七、思考题，完成实验报告七、思考题，完成实验报告11什么是分段盐析，为什么要分段盐析？什么是分段盐析，为什么要分段盐析？2SOD2SOD有哪些用途？有哪些用途？
VIP
