免疫学技术有在食品安全检测中的应用抗原的准备抗体的制备常用的免疫学检测技术第一节抗原的准备天然抗原的制备人工抗原的制备合成抗原抗原制备的主要技术途径天然抗原——分离、纯化半抗原——人工合成、载体联接抗原肽——合成、基因工程制备天然抗原的制备颗粒抗原的制备可溶性抗原蛋白抗原多糖抗原颗粒抗原的制备1、血红细胞抗原的制备：动物的新鲜血液+抗凝剂离心去上清NS悬浮离心洗涤三次（2000转/分）绵羊红细胞的制备流程图4℃可保存3周取适量NS洗涤3次2000r/min10minNS稀释至2～5%摇动15-20min颗粒抗原的制备2、细菌抗原的制备细菌培养（37℃，24小时）杀菌（100℃，2小时）NS稀释菌体抗原细菌细胞抗原的制备流程图液体培养或斜面培养37℃24h100℃水浴2～2.5h杀菌无活菌试验NS稀释成8～10亿/mlO菌体抗原种类：蛋白质多糖和细菌毒素。细胞内存在的部位：胞外抗原和胞内抗原。胞外抗原:收集培养液或分泌物。胞内抗原:提取、分离和纯化。可溶性抗原的分离纯化胞内抗原的提取、分离和纯化细胞的破碎分离纯化1.酶处理法2.冻融法3.超声破碎法4.表面活性剂处理细胞的破碎1、酶处理法常用酶类：溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶等特点：①适用于多种微生物；②作用条件温和；③内含物成分不易受到破坏；④细胞壁损坏的程度可以控制。2、冻融法•原理：因突然冷冻，细胞内冰晶的形成及胞内外溶剂浓度的突然改变而破坏细胞。•方法：将待破碎的细胞置冰箱内冻结，然后缓慢融化，如此反复两次，大部分组织细胞及细胞内的颗粒可被融破。•特点：适用于组织细胞，对微生物细胞作用较差。3、超声破碎法原理：①利用超声波的机械振动而使细胞破碎。②超声波使用的频率从1kHz～20kHz，③间歇进行，避免长期超声产热，导致抗原破坏。特点：①操作简单，重复性较好，节省时间；②多用于微生物和组织细胞的破碎。4、表面活性剂处理法原理：在适当的温度、pH及低离子强度的条件下，表面活性剂能与脂蛋白形成微泡，使膜的渗透性改变或使之溶解。常用的有：十二烷基硫酸钠(SDS,阴离子型)、二乙胺十六烷基溴（阳离子型）、聚山梨酯（非离子型）、新洁尔灭等。应用：破碎细菌，且作用比较温和。抗原的纯化1.超速离心法2.选择性沉淀法3.凝胶层析法4.离子交换层析法5.亲合层析法1、超速离心法原理:利用各颗粒在梯度液中沉降速度不同，使具有不同沉降速度的颗粒,处于不同密度的梯度层内，达到彼此分离的目的。应用：用于少部分大分子抗原和一些比较轻的抗原物质的分离，如IgM、载脂蛋白A、B等。2、选择性沉淀法原理：根据蛋白质理化特性的差异，采用各种沉淀剂或改变某些条件促使蛋白质抗原成分沉淀，从而达到纯化的目的。常用方法：盐析沉淀法（不同盐浓度则溶解度不同），常用33～50％饱和度的硫酸胺。特点：简单方便，纯度不高，粗提球蛋白。应用：在大量制备中先用此法粗提，再纯化。3、凝胶层析法•原理：凝胶具有三维空间多孔网状结构的物质，经适当溶液平衡后，装入层析柱。当含有各种分子大小不一的混合物加在凝胶床面时，由于分子大小的不同先后被洗脱出来，从而实现对不同分子大小的物质进行分离。•常用的如：如葡聚糖凝胶填料（sephadex柱）凝胶层析（分子筛）4、离子交换层析法•原理：利用带离子基团的纤维素或凝胶，吸附交换带相反电荷的蛋白质抗原。各种蛋白质的等电点不同，所带电荷不同，与纤维素结合的能力有差别。当梯度洗脱时，逐步增加流动相的离子强度，使加入的离子与蛋白质竞争纤维素上的电荷位置，从而使血清中的蛋白质分成γ球蛋白、α球蛋白、β球蛋白和清蛋白等几个部分而被洗脱下来，达到分离纯化的目的。离子交换层析+++———————++++++++——+++——++5、亲和层析法•原理：依据抗原抗体的生物学活性进行分离和提纯的技术。将纯化的抗IgG附着于惰性的固相基质上，制成免疫吸附层析柱。当样品流过此柱时，待分离的IgG可选择性地与免疫吸附剂上的特异性配体(抗IgG)结合；当改变洗脱条件可重新解离，将待分离的Ig洗脱下来，达到纯化的目的。•优点：提取纯度高、抗原抗体不失活性。正常细胞＋标记细胞洗滴标记细胞被酶裂解加入特异性抗体其它...
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