第二十五章基因结构功能分析和疾病相关基因克隆鉴定人民卫生出版社PEOPLE'SMEDICALPUBLISHINGHOUSE自录第一节基因结构分析第二节基因功能研究第三节疾病相关基因鉴定克隆原则第四节鉴定克隆疾病相关基因的策略和方法人民卫生出版社PEOPLE'SMEDICALPUBLISHINGHOUSE综合教材重点难点掌握鉴定基因顺式作用元件的基本技术；检测基因表达丰度的技术及原理；分析表达产物的主要技术；基因功能研究的方法技术。熟悉疾病相关基因鉴定克隆原则；克隆疾病相关基因的策略和方法。了解利用基因编辑技术鉴定基因功能。人民卫生出版社PEOPLE'SMEDICALPUBLISHINGHOUSE第一节基因结构分析人民卫生出版社PEOPLE'SMEDICALPUBLISHINGHOUSE综合教材一、鉴定基因的顺式元件是了解基因表达的关键基因的顺式元件包括基因编码区启动子区转录起始点的确定其他顺式作用元件人民卫生出版社PEOPLE'SMEDICALPUBLISHINGHOUSE(一)确定基因编码区分析技术综合教材1.用数据库分析基因编码序列在基因数据库中，初步明确基因的编码序列，并可对其编码产物的基本性质进行分析。2.用cDNA文库法分析基因编码序列cDNA末端快速扩增(RACE)技术是高效钓取未知基因编码序列的一种方法。3.用RNA剪接分析法确定基因编码序列选择性剪接的转录产物可以通过基因表达序列标签(expressionsequencetag,EST)的比较进行鉴定。人民卫生出版社PEOPLE'SMEDICALPUBLISHINGHOUSE(二)基因启动子结构分析技术符合教材dsDNA单链末端标记变性凝胶电泳DNA结合蛋白无蛋白蛋白—DNAMDNaseI切割(控制反应时间)蛋白质结合区长短不同的片段蛋白质结合区不被酶切对空白区域相应的DNA进行克隆和测序，并对照未经结合反应的DNA序列标志，即可鉴定蛋白质结合区的DNA序列DNaseI足迹法的原理人民卫生出版社PEOPLE'SMEDICALPUBLISHINGHOUSE(三)基因转录起点分析技术符合教材转录起点(transcriptionstartsite,TSS)RNA用CIAP处理全长mRNAAAA…3'5'mG-p-p-p₇5'降解的mRNA,rRNA,tRNA和DNA3'用TAP处理AAA…3'5'去帽的全长mRNAP连接5'RACE接头5去帽的mRNA与AAA…3'5'RACE接头结合逆转录5cDNA随机9核苷酸引物AAA…3'5:RACE外侧引物巢式PCR5'RACE三内侧引物GSP2GSP1[j'鉴定TSS的原理人民卫生出版社PEOPLE'SMEDICALPUBLISHINGHOUSE符合教材二、检测基因的拷贝数是了解基因表达丰度的重要因素DNA印迹是根据探针信号出现的位置和次数判断基因的拷贝数实时定量PCR是通过被扩增基因在数量上的差异推测模板基因拷贝数的异同DNA测序是最精确的鉴定基因拷贝数的方法人民卫生出版社PEOPLE'SMEDICALPURLISHINGHOUSE命合收账三、分析基因表达的产物可采用组学方法和特异性测定方法基因表达产物包括RNA和蛋白质/多肽，因此分析基因表达可以从RNA和蛋白质/多肽水平上进行。人民卫生出版社符合教材(一)通过检测RNA而在转录水平分析基因表达待克隆目的片段T7或SP65'3°限制性内切酶使载体线性化T7或SP65'3°依赖DNA的总RNA池5'3°标记的单核苷酸RNA聚合酶3'杂交反应5'标记的反义RNA探针s3'5'3'RNaseA和RNasel3's3°5'变性电泳检测21RNA探针RNA杂交片段核糖核酸酶保护实验的原理PEOPLE'SMEDICALPUBLISHINGHOUSE人民卫生出版社符合教材(二)通过检测蛋白质/多肽在翻译水平分析基因表达蛋白质印迹技术酶联免疫吸附实验免疫组化实验流式细胞术蛋白质芯片和双向电泳人民卫生出版社PEOPLE'SMEDICALPUBLISHINGHOUSE综合教材1.用蛋白质印迹技术检测蛋白质/多肽2.用酶联免疫吸附实验分析蛋白质/多肽酶联免疫吸附实验(ELISA)也是一种建立在抗原-抗体反应基础上的蛋白质/多肽分析方法，其主要用于测定可溶性抗原或抗体。人民卫生出版社PEOPLE'SMEDICALPUBLISHINGHOUSE综合教材3.用免疫组化实验原位检测组织/细胞表达的蛋白质/多肽免疫组化实验包括免疫组织化学和免疫细胞化学实验，二者原理相同，都是用标记的抗体在组织/细胞原位对目标抗原(目标蛋白质/多肽)进行定性、定量、定位检测。人民卫生出版社PEOPLE'SMEDICALPUBLISHINGHOUSE综合教材4.用流式细胞术分析表达特异蛋白质的阳性细胞流式细胞术(flowcytometry)通常利用荧光标记抗体与抗原的特异性结合，经流式细胞仪分析荧光信号，根据细胞表达...
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