专题5DNA和蛋白质技术课题3血红蛋白的提取和分离一、基础知识P64-66二、实验操作P66-701.提取、分离的原理2.提取、分离的方法凝胶色谱法（分配色谱法）电泳法3.缓冲溶液课题3血红蛋白的提取和分离大分子通过多孔凝胶颗粒的____，路程____移动___小分子通过多孔凝胶颗粒的____，路程____移动___1、概念：据_____________的大小分离蛋白质的有效方法2、凝胶：____________________3、原理：P65图5-13间隙较短较快内部较长较慢相对分子质量一些微小多孔的球体凝胶色谱法P64（分配色谱法）分离大分子小分子多孔凝胶颗粒混合物上柱洗脱大分子流动快小分子流动慢收集大分子收集小分子电泳法分离、鉴定1.概念：_________在_____的作用下发生迁移的过程带电粒子电场分子带电性质的差异、分子形状、大小不同带电分子在电场中的迁移速度不同2.分类：____________电泳和________________电泳琼脂糖凝胶聚丙稀酰胺凝胶3.原理：阴极阳极4.决定蛋白质移动的原因：蛋白质性质决定运动方向决定运动速率电荷性质电荷多少分子形状分子大小√√√√5.为测定蛋白质分子大小,常用_______________凝胶电泳SDS-聚丙稀酰胺6.SDS的作用：SDS所带电荷大大多于蛋白质原有电荷，掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳时蛋白质移动完全取决于蛋白质分子大小电泳法应用——测定蛋白质分子大小P66朝着与其所带电荷相反的电极移动【例2】使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于（）A电荷的多少B分子的大小C肽链的多少D分子形状的差异B血红蛋白的提取和分离的过程血红蛋白的提取和分离的过程样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定｛红细胞的洗涤血红蛋白的释放取材分离血红蛋白溶液透析｛凝胶色谱柱的制作凝胶色谱柱的填装样品的加入与洗脱｛SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶色谱法二、实验操作1.取样2.洗涤红细胞哺乳动物血液柠檬酸钠粗分离纯化纯度鉴定样品处理3.释放血红蛋白抗凝剂P67目的：血红蛋白的提取和分离二、实验操作1.取样2.洗涤红细胞哺乳动物血液低速短时间离心洗涤：5体积生理盐水缓慢搅拌10min柠檬酸钠目的:__________去除杂蛋白血浆—白细胞—红细胞—粗分离纯化纯度鉴定样品处理3.释放血红蛋白抗凝剂P67目的：重复三次，直至上重复三次，直至上清液中已清液中已没有黄色没有黄色胶头吸管吸出洗涤次数过少：离心速度过高时间过长：使白细胞和淋巴细胞使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果等一同沉淀达不到分离的效果P69P69无法除去血浆蛋白无法除去血浆蛋白二、实验操作1.取样2.洗涤红细胞哺乳动物血液低速短时间离心洗涤：5体积生理盐水缓慢搅拌10min柠檬酸钠目的:__________去除杂蛋白血浆—白细胞—红细胞—粗分离纯化纯度鉴定样品处理3.释放血红蛋白蒸馏水、甲苯①蒸馏水的作用___________________②甲苯的作用_____________________③充分搅拌的目的是________________使红细胞吸水胀破溶解红细胞的细胞膜加速红细胞的破裂抗凝剂P67目的：重复三次，直至上重复三次，直至上清液中已清液中已没有黄色没有黄色胶头吸管吸出4.分离血红蛋白粗分离纯化纯度鉴定样品处理5.透析有机溶剂脂类物质血红蛋白溶液红细胞破碎物沉淀离心—过滤—分液目的:_____________去除小分子杂质透析袋是______膜半透高速长时离心？磷酸缓冲液:维持pH稳定，保持血红蛋白的正常特性粗分离纯化纯度鉴定样品处理6.凝胶色谱法(1)凝胶色谱柱的制作(2)凝胶色谱柱的装填(3)样品的加入和洗脱①凝胶装填时尽量______，降低凝胶颗粒间的空隙。②装填凝胶柱时不得有______,因为_________________________________________________。紧密气泡气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果(3)样品的加入和洗脱(1)“加入”的注意事项：p68①不触及并破坏凝胶面②贴壁加样③吸管管口沿管壁环绕移动装填加样洗脱血红蛋白的提取和分离的过程血红蛋白的提取和分离的过程样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定｛红细胞的洗涤血红蛋白的释放取材分离血红蛋白溶液透析｛凝胶色谱柱的制作凝胶色谱柱的填装样品的加入与洗脱｛SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶色谱法（1）凝胶色谱柱的制作：①取长40厘米，内径1....
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