17:46:4817:46:48荧光分光光度法测定荧光分光光度法测定面粉中核黄素面粉中核黄素（（VBVB22））一、实验目的二、实验原理三、FL-4500型气相色谱仪四、实验步骤五、数据处理六、思考题复旦化学系教学实验中心包慧敏17:46:4817:46:481、掌握面粉样品的消化方法，了解溶液的pH值等对核黄素荧光强度的影响。2、了解荧光分光光度计的主要结构及工作原理，掌握其正确使用方法。3、荧光分析法基本原理和学习测绘核黄素的激发光谱和荧光光谱，标准曲线法定量分析。一、实验目的一、实验目的17:46:4817:46:48二、实验原理二、实验原理1、荧光、荧光分子/荧光物质2、荧光分析法：特点、定量方法3、核黄素VB2：结构、性质、面粉中提取方法4、荧光分光光度计：结构、原理、操作17:46:4817:46:48荧光产生的机制——去活化过程问题问题1.1.荧光、荧光分子荧光、荧光分子17:46:4817:46:48强荧光物质强荧光物质结构特点：→、共轭﹡体系、刚性平面结构、取代基如荧光素和酚酞结构十分相似，荧光素在溶液中有很强的荧光，而酚酞没有。如芴和联苯在相同的条件下，荧光量子产率约为1和0.1817:46:4817:46:48影响荧光发射溶液环境因素p.362：（a）溶剂效应：取决于荧光体和溶剂的化学结构、极性、重原子效应（b）温度：T↑φf↓（c）pH平衡解离关系对f.max、φf均有影响溶液荧光的猝灭p.364荧光物质分子与溶剂分子或溶质分子之间相互作用而导致荧光强度下降的现象称为荧光的猝灭（或熄灭）引起荧光猝灭的物质称为荧光猝灭剂。17:46:4817:46:48问题问题2.2.分子荧光分析法分子荧光分析法17:46:4817:46:481.原子光谱与分子光谱原子光谱：电子能级跃迁；分子光谱：电子能级、振动能级、转动能级跃迁2.吸收光谱与发射光谱吸收光谱：从低能级向高能级跃迁，使光的强度减弱；发射光谱：从高能级跃迁回低能级，相应的能量以光的形式辐射出来3.关系原子光谱：原子吸收光谱、原子发射光谱；分子光谱：分子吸收光谱（可见、紫外、红外吸收光谱）光谱名称的问题：17:46:4817:46:48原子光谱V.S.分子光谱原子光谱/线光谱：电子跃迁能级（单重态、三重态）分子光谱/带光谱：电子跃迁能级分子振动能级分子转动能级17:46:4817:46:48激发光谱荧光光谱em.max处IF～ex吸收光谱V.S.发射光谱17:46:4917:46:49图15-3三维荧光光谱的两种表示（b）等高线光谱图（a）等角三维投影图分子荧光光度法的一些基本概念激发光谱、荧光光谱、三维荧光光谱用途？17:46:4917:46:49荧光强度IF与荧光物质的溶液浓度c成线性关系IF=2.3FI0bcb—试样的吸收光程—摩尔吸光系数F—荧光发射的量子产率IF—荧光强度当I0及b一定稀溶液中c—试样浓度IF=kcI0—入射光强度荧光定量分析的基础17:46:4917:46:49标准曲线法（工作曲线法）1.最大激发波长、最大吸收波长的选择；2.系列标准溶液绘制工作曲线；3.测定未知溶液，查得其浓度。标准曲线法求解K：（1）图解法（2）解析法17:46:4917:46:49灵敏度高：测定下限在0.1~0.001gmL，比分光光度法高2~4个数量级。光强I与I0的信号差别～荧光发射的光强选择性高：适当选择激发光波长和荧光测定波长产生荧光的化合物有限，不及分光光度法广泛，干扰物质较少分子荧光分光光度法分子荧光分光光度法v.s.v.s.紫外紫外--可见分光光度法可见分光光度法17:46:4917:46:49三、三、F-4500F-4500型荧光分光光度计型荧光分光光度计比色皿：？样品槽：17:46:4917:46:49F-4500F-4500型荧光分光光度计光路图型荧光分光光度计光路图17:46:4917:46:491、开机Power-Xelamp-Main启动软件FLSolutionsProgramF-4500型荧光分光光度计的使用17:46:4917:46:492、波长扫描wavelength??ScanStart—Method—Sample—Pre-scan—Measure—数据处理—ReportMethod:F-4500型荧光分光光度计的使用17:46:4917:46:4911、试样溶液制备、试样溶液制备22、实验条件的选择、实验条件的选择33、标准曲线的绘制及样品的测定、标准曲线的绘制及样品的测定四、实验步骤四、实验步骤17:46:4917:46:49关于核黄素关于核黄素VBVB22、面粉中提取方法、面粉中提取方法面粉主要成分淀粉、蛋白质、脂肪、矿物质、维生素等。《营养强化...
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