59第五章基因克隆技术基因克隆技术是分子生物学的核心技术，其目的是获得某一基因或DNA片段的大量拷贝，用于深入分析基因的结构与功能，并可达到人为改造细胞以及物种遗传性状的目的。基因克隆的一项关键技术是DNA重组技术，它利用酶学方法将不同来源的DNA分子进行体外特异性切割，重新拼接组装成一个新的杂合DNA分子。在此基础上将杂合DNA分子转入一定宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子，此过程称基因克隆。有目的地通过基因克隆技术，人为操作改造基因，改变生物遗传性状的系列过程总称为基因工程。基因克隆的一般程序为：一、获取目的基因目的基因就是需要研究的特定基因或DNA片段。获取目的基因的主要方法：1、用限制性内切酶酶解染色体DNA，构建基因组文库，再从基因组文库中筛选目的基因。该法的优点是获得的目的基因的组织结构与天然基因完全相同，在结构基因中也含有内含子序列，但是也正因为这一点构成了该法最大缺点，即含有内含子的基因在原核细胞中不能表达。原因是原核细胞不能识别并剪切插入顺序(内含子)，因而也不能表达出正确的基因产物。2、分离纯化细胞中的mRNA，以mRNA为模板，在反转录酶作用下生成cDNA第一链，再以cDNA第一链为模板在DNA聚合酶作用下生成双链cDNA,构建cDNA文库，从中筛选所需的目的基因。此法仅用于筛选为蛋白质编码的结构基因。因成熟的mRNA分子中已经切除了内含子序列，具有完整的阅读框架，可在原核细胞中正确表达。3、人工体外合成基因：由于当前人工体外合成DNA的长度有限，此法仅用于制备小分子生物活性多肽基因和小分子量蛋白基因。在基因较大情况下，常需先合成多个DNA片段，然后拼接成完整的基因，此法还要求目的基因的全部碱基顺序已被阐明。4、PCR法扩增基因：PCR(聚合酶链式反应)技术的出现和发展，为目的基因的寻找提供了有力技术工具。用PCR法可选择性扩增基因组中所要研究的个别基因或DNA片段，或用反向PCR技术，先将特定mRNA反转录为cDNA第一链，然后再进行扩增。用PCR法筛选基因，需要对目的基因的DNA序列至少有部分了解。二、选择适当的载体按上述方法制备的目的基因如果没有合适的载体协助，很难进入受体细胞，即使能进入，往往也不能进行复制和表达，因为这些外源性DNA一般不带有复制调控系统。为了保证目的基因或外源DNA片段能在细胞内克隆，必须将它们与适当的载体连接。理想的载体应该是：(1)分子量较小，能在细胞内自主复制的环状或线状DNA分子；(2)具有特异的限制性酶切位点，便于外源DNA片段的插入，且有明显的遗传筛选标志，如抗药性或插入失活等，以利于阳性克隆的筛选；(4)具有生物安全性。常用的克隆载体可分为三类，即质粒、噬菌体及病毒。由于天然载体用于基因克隆存在许多缺点，现用载体实际上是在天然载体基础上进行改造而成。1、质粒载体质粒是细菌染色体外小型环状DNA复制子，质粒载体是在天然质粒的基础上人工改造拼接而成。质粒载体具有如下特点：分子相对较小(3~10kb)；含松弛型复制子因而在60宿主细胞的拷贝数高；在复制子外适当位置有由多个单一内切酶位点组成的多克隆区，极有利于外源DNA片段的插入；具有抗药性及插入失活标记，可以从平板中直接筛选阳性重组子。但由于质粒分子太小，只能接受小于15kb的外源DNA片段的插入。因此，插入片段过大，会导致重组子扩增速度减慢甚至插入片段丢失。2、噬菌体载体目前使用的噬菌体载体主要有λ噬菌体、Cosmid及M13噬菌体等。λ噬菌体是一种能感染大肠杆菌的病毒，其基因组为线状双链DNA分子。在λ噬菌体DNA(λDNA)的中间1/3处，是可被替换而不影响噬菌体生长的“非生活区”，此区的DNA可通过遗传工程技术由外来DNA片段所替代。λDNA作为载体的优点是：在体外可包装成病毒颗粒高效地感染大肠杆菌；载体容量大，可将23~25kb的外源DNA片段引入其内；筛选和保存较为方便。M13也是大肠杆菌噬菌体，其基因组为单链线性DNA分子。感染大肠杆菌后，此单链DNA转变为复制型双链DNA。克隆复制后，仍以单链形式包装成新的噬菌体释放到介质中。M13DNA分子中有一长507个核苷酸的小“非生活区”可以被外来DNA片段取代。M13载体的主要优点是重组的M13DNA仍为单链结构...
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