丁基苯酞对线粒体呼吸链复合酶活性的影响熊杰,冯亦璞3(中国医学科学院、中国协和医科大学药物研究所,北京100050)摘要目的:阐明正丁基苯酞(dl232n2butylphthalide,dl2NBP)改善缺血脑能量代谢的机制。方法:用分光光度法测定局灶性脑缺血大鼠脑线粒体呼吸链复合酶I,II,III和IV活性的改变,并观察dl2NBP对这些变化的影响。结果:缺血时复合酶II活性升高,IV的活性显著降低;再灌后,复合酶I活性升高,II的活性降低。在缺血前10min给予dl2NBP(5mg·kg-1或10mg·kg-1,ip)能逆转缺血2再灌引起的上述复合酶活性改变,尤其是使缺血后急剧降低的复合酶IV活性得到明显提高。同时NBP(d2,l2,dl2)还能逆转低糖低氧造成的原代培养大鼠皮质细胞呼吸链复合酶IV活性降低。结论:NBP能够改善缺血脑内能量状态是直接作用于脑线粒体的结果,而d2NBP起着主要作用。关键词正丁基苯酞;局灶性脑缺血;呼吸链复合酶;培养神经细胞丁基苯酞(dl2n2butylphthalide,dl2NBP)是源于天然的化学合成药物,药理学实验表明有良好的抗脑缺血和脑保护作用,尤其是能够明显提高缺血小鼠脑内ATP和磷酸肌酸(phosphocreatine)水平,从而显著改善缺血期ATP耗竭造成的脑线粒体结构与功能损伤[1～4]。为进一步阐明dl2NBP改善局灶性脑缺血大鼠脑内能量供应的机制,我们采用插线法造成的大鼠大脑中动脉阻断(middlecerebralarteryocclusion,MCAO)2再灌模型和原代培养大鼠皮质细胞,从线粒体呼吸链电子传递的角度,分析了dl2NBP预防给药对缺血1h和再灌3h及6h时,大鼠脑内线粒体呼吸链复合酶I～IV的活性,以及它对原代培养大鼠皮层细胞低糖低氧处理6h造成的呼吸链复合酶IV活性改变的影响。材料与方法试剂与药品dl2NBP为本所合成室提供,纯度>96%,用Tween80制成0105mol·L-1混悬液。抗霉素(antimycinA)(混合型),溶于50%乙醇中,浓度为100μg·ml-1。鱼藤酮(rotenone),溶于无水乙醇,浓度为015mmol·L-1。CoQ10,溶于丙酮,浓收稿日期:1998204208基金项目:国家科委1035工程基金(9422D201);国家自然科学基金重大项目(29790122)3联系人Tel:(010)63165173,Fax:(010)63017757,E2mail:FengYP@public.gb.com.cn度为6mmol·L-1,临用前以无水乙醇稀释10倍使用。NADH(reducednicotinamideadeninedinu2cleotide),临用前配制。以上试剂均购于Sigma公司。DCPIP(Sodium2,62dichlorophenolindophenol),购于北京市化学试剂厂。细胞色素C(cytochromeC),购于上海生物技术研究所,使用前按要求处理。其它试剂均为国产分析纯。Ubiquinol210(CoQ10的还原型产物)的制备参考文献[5,6]略作修改。方法如下:用前将CoQ10816mg(10μmol)完全溶解于四氢呋喃2ml中,加入NaBH41mg,反复吹打至溶液由黄色变为无色,再加入无水乙醚2ml萃取2次,合并萃取液后,挥干乙醚,所得淡黄色粉末溶于1ml四氢呋喃和乙醇的混合液(1∶1),即得10mmol·L-1的ubiquinol210,以011mol·L-1HCl10μl酸化后使用。缺血再灌模型[7,8]及线粒体的制备[9]体重300～350g♂Wistar大鼠50只,购自中国医学科学院实验动物繁殖中心。用插线法制备大脑中动脉阻断的缺血再灌模型。动物经水合氯醛(360mg·kg-1,ip)麻醉后,沿颈正中切开,仔细分离左侧颈内、颈外动脉(ICA,ECA),将一根长510cm,直径0126mm的圆头硅化尼龙线,由ECA插入ICA约210cm,阻断大脑中动脉开口处,缺血1h,小心抽出尼龙线(缺血组立即断头取脑),结扎ECA开口,伤口缝合后,放回原笼,分别再灌3h和6h,全过程保持室温24～25℃。给药组在缺血前10minipdl2NBP5mg·kg-1或10mg·kg-1。·142·药学学报ActaPharmaceuticaSinica1999,34(4)∶241～245整个线粒体制备过程均在4℃进行。手术动物到达再灌时间点后,立即断头,迅速取出完整缺血侧大脑于玻璃匀浆器中,加入0125mol·L-1蔗糖溶液5ml,用手匀浆15次。匀浆液铺于等体积0134mol·L-1蔗糖溶液上,700×g离心10min,取上清液缓慢加速至5000×g离心10min,去上清液,沉淀混悬于0125mol·L-1蔗糖溶液210ml,于5000×g离心20min,所得沉淀即为线粒体,重复离心清洗1次,悬于0125mol·L-1蔗糖溶液,以Lowry法[10]测定蛋白含量,调节蛋白至1mg·ml-1,-20℃分装保存。原代培养大鼠皮质细胞的低氧低糖损伤及线粒体的制备参照Choi[11]等神经细胞原代培养方法进行...
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