第二节分子生物学技术[学习目标]1.简述PCR技术的原理及基本操作步骤。(重难点)2.尝试进行DNA片段的PCR扩增。(难点)知识点一|PCR扩增的原理和过程1．细胞内DNA复制的条件原料4种脱氧核苷酸模板2条DNA母链酶解旋酶和DNA聚合酶引物使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸2.PCR扩增技术(1)概念：在体外快速扩增特定基因或DNA序列(目的DNA片段)的实验技术，又称为体外基因扩增技术或DNA扩增技术。(2)PCR技术的原理：①条件：DNA模板、TaqDNA聚合酶、脱氧核苷酸引物、四种脱氧核苷酸。②PCR扩增的特点：快速、简便和灵敏。③进行PCR的先决条件：待扩增的DNA片段3′端的脱氧核苷酸序列要为已知。④引物序列确定的依据是：被扩增区域的3′端边界DNA序列。3．PCR反应的过程—[合作探讨]探讨1：什么是引物？DNA复制时为什么需要引物？提示：所谓引物是指两段与待扩增的DNA序列互补的一小段DNA或RNA片段。在DNA扩增时，DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的3′端延伸DNA链，因此克隆DNA时应加入两种引物。探讨2：为什么PCR需要耐高温的TaqDNA聚合酶？提示：因为PCR反应过程中变性和延伸都需要较高的温度，一般的DNA聚合酶在这种温度下会变性失活，只有耐高温的TaqDNA聚合酶在这种温度下可以正常发挥作用。探讨3：如果某DNA片段经过PCR反应扩增了4个循环，请计算双链中都含引物的DNA分子的数目。提示：由于DNA复制具有半保留复制的特点，所以含有母链的DNA分子只有两个，其他分子的两条链都含有引物。复制4次共形成24＝16(个)，有14个DNA分子的两条链均含引物。[思维升华]1．PCR解旋与复旋的原理：DNA热变性的原理2．PCR的反应过程(1)变性：当系统温度上升到90℃以上时，双链间的氢键打开，DNA解旋为单链，如图：(2)复性：当系统温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对分别与两条单链DNA结合，如图：(3)延伸：当系统温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸(A，G，C，T)在DNA聚合酶的作用下，从引物的3′末端开始，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链，如图：3．PCR扩增的计算理论上DNA呈指数方式扩增。若开始只有一个DNA提供模板，则循环n次后有2n个；若开始有N0个DNA提供模板，则循环n次后获得的子代DNA数目为N0·2n个。1．下列有关PCR的描述，不正确的是()A．PCR的技术原理是DNA复制B．是一种酶促反应，需耐高温的解旋酶和DNA聚合酶C．一个DNA片段经PCR扩增，可形成2n个DNA片段(n代表循环的次数)D．PCR技术利用DNA的热变性来控制DNA的解聚与结合B[PCR技术是利用热变性原理让模板DNA分子解旋的而不是通过解旋酶的作用。]2．PCR技术有效地解决了因为样品中DNA含量太低而难以对样品进行研究的问题，从而被广泛应用，此过程需要TaqDNA聚合酶。请回答有关问题：(1)体内DNA复制过程中用解旋酶打开双链DNA，而PCR技术中应用___。(2)TaqDNA聚合酶是从水生耐热细菌Taq中分离的。①为什么在热泉中只筛选出来Taq细菌呢？__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。②TaqDNA聚合酶的功能是________________________________________。③TaqDNA聚合酶的化学本质为蛋白质，可用________________法和________________法进行分离。(3)与体内DNA复制相比较，PCR反应要在________中才能进行，并且要严格控制________条件。(4)PCR中加入的引物有________种，加入引物的作用是________________。[解析](1)PCR技术中用高温使DNA分子中的氢键打开，从而解旋。(2)①利用细菌特有的特性而与其他细菌区分开来，Taq细菌具有耐高温的特性，放在高温环境下，其他绝大多数细菌死亡，而Taq细菌得以保留。②在DNA分子复制中，TaqDNA聚合酶将一个脱氧核苷酸的脱氧核糖和另一脱氧核苷酸的磷酸连接形成磷酸二酯键。③蛋白质的分离可以根据其分子大小和带电的性质和多少使之分离，即凝胶色谱法和电泳法。(3)PCR反应是在一定的缓冲溶液中进行的，并需严格控制好温度条件。(4)PCR与体内DNA复制过程中的原料是完全相同的，并加入小段...
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