修饰的ORF5基因增强猪繁殖与呼吸综合征DNA疫苗的体液免疫江云波,方六荣,肖少波,牛传双,张辉,陈焕春*(华中农业大学动物医学院,湖北武汉430070)摘要:为了提高猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5基因DNA疫苗的免疫效力,将通用型辅助性T淋巴细胞表位(PADRE)插入ORF5的中和表位和覆盖表位间,获得修饰后的ORF5基因ORF5M。在此基础上,进一步构建了ORF5M的真核表达质粒pCI-52M。间接免疫荧光证实体外表达后,免疫BALB/c小鼠,检测免疫后的ELISA抗体和中和抗体,并与未经修饰的ORF5基因真核表达质粒pCI-52进行比较。结果表明,修饰后的DNA疫苗pCI-52M诱导的ELISA抗体和中和抗体均明显优于未经修饰的DNA疫苗pCI-52,是一种具有良好开发前景的PRRS新型疫苗。关键词:猪繁殖与呼吸综合征病毒;ORF5基因;PADRE表位;DNA疫苗中图分类号:S852.65;Q78文献标识码:A文章编号:1005-4545(2005)01-0001-03收稿日期:2003-09-21基金项目:武汉市青年科技晨光计划资助项目(20025001041)作者简介:江云波(1980-),男,硕士。*通讯作者猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,PRRSV)引起的一种严重危害养猪业的新传染病[1]。免疫接种是预防和控制该病的主要措施,但现有的商品化疫苗(弱毒苗和灭活苗)均存在一定程度的缺陷。其中弱毒苗虽然免疫效果较好,但存在散毒和返强的危险性,并且返强的几率相当高[2];灭活苗与弱毒苗相比,虽然安全性较好,但产生的保护力不强,需要反复多次的免疫接种,而且效果不稳定,还经常导致免疫失败[3]。可以说,缺少安全、有效的疫苗是目前预防和控制PRRS发生与流行甚至大暴发的主要障碍,迫切需要安全、有效、廉价的新型疫苗。由ORF5基因编码的糖基化囊膜蛋白GP5,是PRRSV的主要结构蛋白,参与体液免疫与细胞免疫,因此是发展新型疫苗的良好目标基因。Pirzaden等[4]用编码GP5的真核表达质粒免疫猪,可使接种猪产生抗GP5的特异性抗体,接种猪可免于强毒攻击造成的全身性病毒血症和肺部病变,并使间质性肺炎和支气管肺泡炎明显减轻。Kwang等[5]用编码4种结构蛋白(GP4、GP5、M、N)的基因构建了4种DNA疫苗免疫猪,以由GP5构建的表达质粒激发的抗体具有最强的中和病毒的能力。但上述研究均发现,表达GP5蛋白的DNA疫苗诱导的中和抗体不高(<1∶8)。最近,Ostrouski等[6]在采用噬菌体表面展示技术确定GP5中和表位时,发现与中和表位紧邻的上游存在一个非中和表位,此表位具有类似于HIV中覆盖表位的覆盖效应[7],也正是这一覆盖表位的覆盖效应,导致GP5中和表位无法充分暴露,从而难以激发很强的中和抗体。基于这一发现,本试验对ORF5基因进行了修饰,即将通用型辅助性T淋巴细胞表位(PADRE)[8]插入GP5的中和表位和覆盖表位间,并比较了修饰与未修饰的ORF5基因DNA疫苗的免疫反应。1材料与方法1.1毒株、质粒和细胞PRRSVYA株系本实验室分离的高致病力野毒株,由本室保存。真核表达质粒pCI-neo购自Promeaga公司。PRRSVYA株完整ORF5基因的原核表达质粒pKG-53和真核表达质粒pCI-52均由本室方六荣博士构建并保存[9]。Marc-145细胞由德国巴伐利亚州动物保健中心Czerny博士赠送,Hela细胞购自中国典型培养物中心。BALB/c小鼠购自湖北省预防医学科学院实验动物中心。1.2工具酶与试剂各种限制性内切酶、T4DNA连接酶均为TaKaRa产品。脂质体转染试剂盒LipofectaMINETM2000为Invitrogen公司产品。DNA快速回收试剂盒购自上海生工生物工程公司。HRP标记的羊抗鼠IgG、FITC标记的羊抗兔IgG均为SBA公司产品。1.3ORF5基因的修饰与表达质粒构建采用PCR扩增和拼接方法,将编码PADRE表位的核苷酸序列引入ORF5基因的中和表位与覆盖表位之间,其中引物P51和P5m1可扩增ORF5基因N端96bp,并同时引入长39bp的PADRE表位,两端依次设计XhoⅠ和PstⅠ酶切位点。P5m2和P52,可扩增ORF5基因后一部分的507bp,两端依次设计PstⅠ和XbaⅠ酶切位点。上述引物均由上海生工生物公程公司合成。引物序列如下:P51:5′-GAACTCGAGAGTATGTTGGGGAAATGCTTGACC-3′P5m1:5′-TTTCTGCAGAGCGGCAGCCTTCAGGGTCCAGGCAGCCACGAACTTGGCGTTGGCGTTGACGAGC-3′P5m2:5′-TTTCTGCAGAGCAACAGCAGCCTCTC-3′P52:5′-TTTTCTAGAGACGACCCCATTGTTCCGC-3...
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