#综述#应用彗星试验检测细胞DNA损伤的原理与方法肖琳1王松1王凡2(1武汉体育学院解剖教研室武汉430079;2四川大学华西医学中心人体解剖学教研室成都610041)=中图分类号>Q523=文献标识码>A环境中多种因素,包括物理的如电离辐射和紫外线(UV),化学的如多种氧化剂及三氯乙烷、丙烯酰氨等,以及混合性因素如老化、吸烟等均可直接或间接造成DNA链的断裂[1,2](singlestrandbreak,SSB)。虽然DNA单链断裂不会影响长链DNA分子的连续性,但双链断裂则会造成DNA片段的移位、异位、丢失等,从而引起遗传性的损伤并影响遗传行为[3]。检测DNA链的断裂是测定DNA损伤程度的有效技术。近年来由Singh等[4]在Osting和Jo-hanson[5]最先提出应用中性微胶电泳技术的基础上改进和建立的彗星试验(cometassay)即单细胞凝胶电泳试验(singlecellgelelectrophoresisSCGE)是检测单个细胞DNA链断裂的新技术,该方法具有灵敏、简便、快速及样品用量少、不需放射性等优点,已广泛应用于放射生物学、DNA损伤与修复、DNA交联、内源性自由基攻击所致的DNA氧化性损伤、遗传毒理学、肿瘤治疗评价及细胞凋亡等领域的研究[6]。它也已用于职业医学,如评价职业有害因素对DNA的损伤,做为职业人群的生物学指标等[7]。目前国内外学者在这方面进行了大量的研究,本文旨在通过相关文献的综述,介绍其原理与方法,以便在国内进行更大的推广。1SCGE测定原理哺乳类细胞和人血淋巴细胞,其DNA的分子量很高且具有严密的超螺旋结构。在理想的实验条件下对淋巴细胞的分离、处埋、裂解、碱处理等过程均保持在避光条件下小心谨慎地操作,使细胞DNA不受损伤,其DNA结构仍象在活细胞中那样完整,外加电泳电场就不会使DNA在凝胶中泳动。因此,在理想条件下,正常对照组细胞DNA在电泳之后仍应保持在原来位置。在SCGE实验中,细胞DNA之所以从原位向电泳电场的阳极迁移,形成彗星图象,其原因是:当细胞DNA受损伤产生链断裂时,DNA的超螺旋结构受到破坏;在细胞裂解液作用下,细胞膜、核膜及其它膜结构受到破坏,细胞内的蛋白质、RNA及其它成分均可进入凝胶而扩散到裂解液中,而核DNA分子量很高不能进入凝胶,只能留在原位。在碱处理和碱性电解液作用下DNA解螺旋,使DNA的断链和碱易变性DNA片段从严密的超螺旋结构中释放出来;由于这些DNA片段分子量很小且碱变性为单链,所以在电泳电场中就可以离开核DNA在凝胶分子筛中向阳极移动,形成彗星状图象。DNA受损伤越严重,产生的断链和碱易变性片段就越多,断链也越小;在相同电泳条件下迁移的DNA量就越多,迁移的距离就越长.因此,通过测定DNA损伤迁移部分的光密度或迁移长度就可定量测定DNA损伤程度,确定电离辐射或其它因素作用剂量与DNA损伤效应之间的关系.2SCGE测定方法211细胞分离和处理(1)人血淋巴细胞分离:从健康人静脉采血0.95-1ml,沿离心管管壁滴加在等体积淋巴细胞分离液液面上,3500r/min离心2min,吸取中间层淋巴细胞于10ml离心管中,加磷酸盐缓冲液(PBS)至5ml,1500r/min离心8min,如此重复洗涤细胞两次,再将细胞悬于PBS,置4e待用。(2)其它细胞的分离制备:对于体外培养的细胞株,若为贴壁生长的细胞,当细胞处于对数生长期时,可弃去旧培养液,加适量0.1%胰蛋白酶Hank.s溶液,在37e下3-5min使细胞脱离瓶壁,用PBS洗涤细胞2-3次,调节至适当的细胞密度即可;若为悬浮培养的细胞,只需用PBS洗涤细胞两次即可。对于实体肿瘤细胞、胸腺、脾及其它组织,可用不锈钢剪去除结缔组织,剪碎,压研通过60目不锈钢网,再用PBS洗涤细胞2-3次,调节至适当细胞密度即可。对于肝细胞的分离制备比较复杂,需经过含胶原酶和透明质酸酶的缓冲液进行器官灌注,再分离肝细胞。(3)紫外线或C-线照射:取新鲜分离的淋巴细胞或其它细胞悬液,用PBS调细胞密度为2@105个细胞/ml。于冰水浴中经紫外线或60Co-C照射,照后细胞置于冰水浴中,并立即用于SCGE测定。(4)化学处理:新鲜分离的淋巴细胞或其它细胞,在SCGE测定前用待测化学物在37e下处理2~4h,细胞密度均为2@105个细胞/ml。然后将细胞保存在4e下或冰水浴中,立即进行测定。#40#SICHUANJOURNALOFANATOMYVOL.12NO.12005212制片(1)磨沙载玻片:用水砂纸(粒度,NO.380)将普通光学显微镜用的载玻片(厚度较薄为宜)单面加水轻磨,使形成的磨...
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