论文第50卷第16期2005年8月www.scichina.com1725细菌Ⅱ型分泌途径控制产碱假单胞菌(Pseudomonasalcaligenes)S2中卵磷脂酶的分泌吕静①李繁①陈三凤①②*李季伦①③(①中国农业大学农业生物技术国家重点实验室,北京100094;②中国农业大学农业部微生物资源及其应用重点实验室,北京100094;③中国农业大学生物学院,北京100094.*联系人,E-mail:chensf@cau.edu.cn)摘要从水稻根际分离筛选出1株降解卵磷脂的有机磷降解细菌菌株S2,通过形态指标、生理生化性状、16SrDNA序列、(G+C)含量以及DNA-DNA杂交分析,鉴定为产碱假单胞菌(Pseudomonasalcaligenes).采用双亲接合的方法将带有Tn5转座子的质粒导入产碱假单胞菌S2菌株中进行转座子插入诱变,从5000个卡那霉素抗性的Tn5插入突变株中,筛选到3株丧失解磷能力的突变株(M808,M1329和M1400)和1株解磷能力增强的突变株(M20).对Tn5插入位点的基因进行DNA测序表明,丧失解磷能力突变株中被突变的基因分别是xcpS,xcpX和xcpW,它们分别编码XcpS,XcpX和XcpW蛋白,这些蛋白是细菌Ⅱ型分泌途径中的主要成分.将xcpS,xcpX和xcpW基因分别构建在pLAFR3载体上,通过双亲接合的方式分别导入上述M808,M1329和M1400三个丧失解磷能力突变株中进行功能互补实验,结果表明这3个基因都能使各自相对应的突变株恢复解磷能力.以上结果表明,在产碱假单胞菌中卵磷脂酶的分泌是通过Ⅱ型分泌途径来完成的.解磷能力的丧失可能是由于Tn5插入xcp基因簇中的某一基因破坏了卵磷脂酶向胞外的分泌,造成突变株不能降解有机磷.在解磷能力增强突变株M20中,被突变的基因与铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)PAO1中的chpA基因(参与细菌的颤动)同源性达88%.关键词Pseudomonasalcaligenes有机磷降解Tn5转座子xcpSxcpXxcpWchpA磷是植物生长发育必需的大量营养元素之一,是核酸、磷脂、植素、ATP等高能物质的组成成分,植物的光合作用和体内的生化过程都必须有磷的参加.植物所利用的磷主要来源于土壤,土壤中磷的总含量为0.02%~0.2%,与其他大量元素相比含量较低.磷主要是以无机磷HPO42−或H2PO4−形式被生物吸收.土壤中能被植物吸收利用的有效态无机磷被称之为有效磷,它一般只占全磷量的2%~3%.据全国土壤普查资料估算,我国74%的耕地土壤缺磷[1].目前,人们一般通过施用磷肥来满足植物对磷的需求.但是,当可溶的无机磷酸盐作为磷肥被施入土壤中时,其中大部分很快与土壤中的Ca2+,Fe3+,Fe2+,Al3+结合,形成难溶性磷酸盐很难被植物吸收利用[2].除无机磷外,有机磷是土壤全磷中的第二大组成成分[2,3].土壤中的有机磷主要来源于有机质、植物以及土壤微生物残体和有机肥料.有机磷主要包括磷酸肌醇(也叫植酸,2%~50%)、磷脂(1%)、核酸(3%)和少量磷酸糖等.磷酸肌醇是磷与蛋白质等多肽结合的有机磷化合物,可与铁、铝离子形成极难溶的化合物,这也是土壤中部分有机磷化合物比较稳定的原因之一.核酸是由若干个核苷酸通过磷酸酯键聚合而成的高分子化合物,分为RNA和DNA两类,广泛存在于一切生物体内.磷脂是含磷酸的类脂质,其中最重要的成分之一是卵磷脂.土壤中的有机磷不能被植物直接吸收,它们在微生物分泌的酶的作用下,逐步降解,最终释放出可以利用的无机态的磷才可被植物吸收利用,这种过程也被称为有机磷的矿化作用.能够将植物难以吸收利用的磷转化为可吸收利用形态的微生物称为解磷菌或溶磷菌,能够矿化有机磷化合物的微生物称之为有机磷微生物,目前报道的降解有机磷细菌主要有Rhizobium,Entero-bacter,Klebsiella,Serratia,Citrobacter,Bacillus,Pseudomonas等[4~8].在矿化作用中,微生物分泌的酶有植酸酶、磷酸酶、核苷酸酶等.其中磷酸酶是降解磷脂的酶的总称,其最适活性因pH不同,而被分为碱性磷酸酶和酸性磷酸酶.磷酸酶的调控是一个很复杂的系统,其活性只有在特殊环境下才能观察到.这些酶的特性,调控和作用机理仍缺乏全面了解,甚至在大肠杆菌和沙门氏菌中仍有待进一步研究.因此到目前为止有机磷的降解研究多集中于菌株的筛第50卷第16期2005年8月论文1726www.scichina.com选和菌株解磷能力的比较.卵磷脂酶属于磷酸酶的一种,它能将卵磷脂水解而释放出磷酸.目前卵磷脂酶的研究主要集中在人类致病菌中卵磷脂酶与致病机理的...
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