边做边学目的DNA片段的体外扩增VIP专享VIP免费

课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段★★分子生物学研究中最强大的实验技术之一分子生物学研究中最强大的实验技术之一★★其本质是在体外模拟细胞内其本质是在体外模拟细胞内DNADNA分子复制的过程分子复制的过程美国科学家穆利斯美国科学家穆利斯(K.B.Mullis)(K.B.Mullis)发明了发明了PCRPCR技术技术19931993年诺贝尔奖年诺贝尔奖（一）（一）DNADNA分子的结构分子的结构CC、、HH、、OO、、NN、、PP1.1.元素组成：元素组成：脱氧核苷酸脱氧核苷酸2.2.基本单位基本单位::一、基础知识一、基础知识脱氧核脱氧核苷酸苷酸脱氧核苷脱氧核苷磷酸磷酸脱氧核糖脱氧核糖含氮含氮碱基碱基嘌呤嘌呤嘧啶嘧啶腺嘌呤（腺嘌呤（AA））鸟嘌呤（鸟嘌呤（GG））胞嘧啶（胞嘧啶（CC））胸腺嘧啶（胸腺嘧啶（TT））一个核苷酸上的一个核苷酸上的磷酸基团上的“－磷酸基团上的“－OH”OH”和和另一个核苷酸分子的第另一个核苷酸分子的第33位碳原位碳原子上的羟基子上的羟基之间失去一分子水，形成之间失去一分子水，形成磷酸二酯键，磷酸二酯键，即在即在相邻的相邻的两个脱氧核苷两个脱氧核苷酸的酸的3’3’和和5’5’碳原子碳原子之间形成磷酸二酯键。数量庞大的四种脱氧核苷酸通之间形成磷酸二酯键。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过过3’3’，，5’-5’-磷酸二酯键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。磷酸二酯键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。通常将通常将DNADNA的羟的羟基“－基“－OH”OH”末端称为末端称为3’3’端，而磷酸基团的末端称为端，而磷酸基团的末端称为5’5’端端3.3.脱氧核苷酸链的形成脱氧核苷酸链的形成脱氧核苷酸链结构简图脱氧核苷酸链结构简图DNADNA分子的平面结构分子的平面结构ATGCAGCT氢氢键键5'端3'端5'端3'端识别：-OH端为3′;磷酸基团的末端为5′。复制过程:(二)DNA的复制解旋酶催化（氢键断裂）解旋：模板（在DNA聚合酶的催化下，利用游离的脱氧核苷酸进行）以母链为模板进行碱基配对母链（旧链）子链（新链）形成两个子代DNA:同时进行(边解旋边复制）组成边解旋复制半保留复制多起点复制参与的组分参与的组分在在DNADNA复制中的作用复制中的作用解旋酶解旋酶DNADNA母链母链44种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸DNADNA聚合酶聚合酶引物引物总结：细胞内总结：细胞内DNADNA复制的基本体系复制的基本体系打开打开DNADNA双链双链提供提供DNADNA复制的模板复制的模板合成子链的原料合成子链的原料催化合成催化合成DNADNA子链子链使使DNADNA聚合酶能够从引物的聚合酶能够从引物的3’3’端开始连接脱氧核苷酸端开始连接脱氧核苷酸解旋酶DNA母链4种脱氧核苷酸DNA聚合酶引物（RNA）打开DNA双链模板合成子链的原料催化子链合成使DNA聚合酶能从引物3′端开始连接脱氧核苷酸思考：体外扩增DNA时，如何提供与体内DNA复制相似条件？变性（80～100℃）TaqDNA聚合酶（耐高温）20～30个核苷酸构成DNA或RNA二、二、PCRPCR（多聚酶链式反应）（多聚酶链式反应）（一）（一）PCRPCR原理原理DNA双链变性（加热80-100℃）复性（缓慢冷却）DNA单链变性的目的：解开双链复性的目的：有利于引物1和引物2与两条单链的结合PCRPCR扩增仪扩增仪PCR扩增仪实际上就是一台能够自动调控温度的仪器，它可以根据DNA的热变性原理，通过自动改变温度，达到扩增DNA片段的目的。1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸高温变性低温复性重复1～3步30轮DNA复制的方向：DNA的合成方向总是从子链的5’端向3’端延伸变性→复性（退火）→延伸（二）（二）PCRPCR的反应过程：的反应过程：（二）（二）PCRPCR的反应过程：的反应过程：5引物15引物255模板DNA（三）PCR的模拟过程各小组以桌上的材料进行演示模板DNA分子体外扩增2次的过程5引物15引物2第二次复制第一次复制555555模板DNA555555552525～～3030次循环（复制）后，模板次循环（复制）后，模板DNADNA的含量可以扩大的含量可以扩大100100万（万（222020）倍以上。）倍以上。练习巩固：下图中PCR第二轮产物a、b、c、d分别是以PCR第一轮产物的哪一条单链DNA为模板复制产生的()A．②①③④B．①④③②C．①②④③D．①②③④体内DNA复制...