山羊角膜内皮细胞的分离培养与鉴定VIP专享VIP免费

农业生物技术学报JournalofAgriculturalBiotechnology2008,16(2):258~263*基金项目:国家高技术研究与发展计划(863)项目(No.2002AA216161)、教育部重点项目(No.03160)和陕西省重大科技专项（No2006KZ05­G1）资助。**通讯作者。Authorforcorrespondence.教授，博士生导师，主要从事哺乳动物胚胎工程及干细胞方面的研究。E­mail:.收稿日期：2007­09­01接受日期：2007­09­26·研究论文·山羊角膜内皮细胞分离培养与鉴定*赵清梅，杨学义，弥胜利，窦忠英**（西北农林科技大学国家干细胞工程技术研究中心陕西分中心，杨凌712100）摘要：比较山羊眼角膜内皮细胞（GCEC）的4种原代分离培养方法，并对分离培养的角膜内皮细胞（CEC）进行鉴定和研究其生长特性。取屠宰1～24月龄关中奶山羊()眼角膜，无菌分离角膜内皮层和Descemet’smembrane，分别用组织块法、胰蛋白酶法、dispase酶法和dispase酶联合胰蛋白酶法分离培养原代CEC，比较经4种方法处理后的细胞离散和贴壁情况，筛选出GCEC最佳培养方法，并纯化该方法培养的CEC，对纯化的细胞进行鉴定和研究其生长特性。结果显示，dispase酶联合胰蛋白酶法为最佳分离纯化角膜内皮细胞的方法。分离纯化的细胞经形态学观察、免疫组化染色、Giemsa染色、扫描电镜和透射电镜鉴定为角膜内皮细胞。说明dispase酶联合胰蛋白酶法为角膜内皮细胞分离培养的理想方法，该方法可为哺乳动物角膜内皮细胞的理论研究和构建组织工程化人工角膜内皮提供种子细胞。关键词：角膜内皮细胞；细胞分离；体外培养；山羊中图分类号:S188文献标识码:A文章编号:1006­1304(2008)02­0258­06Isolation,CultureandIdentificationofGoatCornealEndothelialCellsZHAOQing­mei,YANGXue­yi,MISheng­li,DOUZhong­ying**Fourkindsofisolationandprimaryculturemethodofgoatcornealendothelialcells(GCEC)werecompared,andthegrowthcharacteristicoftheisolatedGCECwasidentified.TheendothelialcellsandlayersincludingtheDescemet’smembraneweresterilelystrippedfrom1～24­monthGuanzhongdiarygoat()eyecornea.TheCECprimarycultureswereestablishedrespectivelybyexplantculturemethod,trypsindigestionmethod,dispasedigestionmethodanddispasewithtrypsindigestionmethod.TheresultsshowedthatthedispasewithtrypsindigestionmethodwastheoptimumCECisolationmethod.TheisolatedandculturedcellswereidentifiedasCECviamorphology,immunostaining,Giemsastaining,NSEstaining,scaningandtransmissionelectronmicroscopeessays,respectively.AllresultsindicatethatdispasewithtrypsindigestionmethodistheoptimummethodtoisolatetheGCEC,andthismethodcanprovideseedcellfortheoreticalresearchesofmammaliancornealendothelialcellsandtissueengineeringcornealendothelium.cornealendothelialcells;cellisolation;cellsculture;goat正常角膜内皮是由一层扁平而有规则的六角形细胞构成，是角膜的重要组成部分。角膜内皮细胞层在前室和角膜基质之间形成屏障并具有离子泵的功能，在维持角膜的透明度和调节基质水化方面起着至关重要的作用（Maurice，1972;BarfortandMaurice,1974）。成年后，角膜内皮细胞失去分裂增殖能力，细胞的密度随着年龄的增长降低，缺失的细胞靠临近细胞的体积增大和移行来代偿，而不是靠细胞的分裂增殖来代偿（Hollingsworth.,2001;Jun,2006;Joyce,2003）。因此，当角膜疾病、角膜损伤和角膜移植中导致大量角膜内皮细胞缺失，超出其代偿能力，使细胞密度降低到维持其生理功能的临界密度，就会导致角膜盲。临床上常采用角膜移植来治疗，但角膜来源有限，不能满足广大患者的需要。组织工程第2期赵清梅等：山羊角膜内皮细胞分离培养与鉴定化人工角膜的兴起，为患者带来新希望，因此，体外培养角膜内皮细胞和构建组织工程化人工角膜成为近年来研究的热点。尽管角膜内皮细胞在正常的生理情况下没有增殖能力，但体外培养中角膜内皮细胞具有增殖能力已被证实。研究发现，角膜内皮细胞并不是退出了细胞周期而是停留在...