第16卷第6期生物化学与生物物理学报1984年11月AOTABl(X)H工M工CAe七B工OPHYSICAS工NICAVol.16,No.6Nov.,1984过碘酸钠氧化辣根过氧化物酶(HRP)中的若干问题及高效果的标记方法*}I五互}宋光承陈彩云(中国预防医学山心寄生虫病研究所,上海)摘要术文研究了过碘酸钠氧化HRP的某些条件。戊二醛和磷酸盐对酶有一定的影响,而低浓度甲醛和醋酸盐缓冲液(HAoB)则无明显影响。氧化的最适pH在5.6左右。过碘酸钠氧化酶的适宜浓度在0.06~O,015肛之间。氧化时间为10~30分钟,过长则影响结合物效价。讨论了加人乙二醇的必要性。醛化的HRP在pHg左右与抗体结合作用的适宜时间为16~24小时,过长则影响酶与抗体的活性,过短则结合不够完全。封闭结合物上多余醛基的KBH‘适宜量为0.1~0.219/Ing酶。本法标记抗体、抗原和葡萄球菌A蛋白的效果均较好,方法简易,标记效果取决于酶是否能与抗体和抗原相结合,以及标记过程中酶和抗体活性是否受影响。用HRP标记抗体或抗原的方法基本上可分成2类。一类系用双功能基团的化合物使酶与抗体随机偶联,如戊二醛一步法〔习。由于酶分子上游离氨基极少,而抗体分子上氨基则相对地多,为了弥补这一缺陷,往往采用8~12个酶分子与1个抗体分子的比值进行调整。戊二醛二步法的原理,主要是HRP的氨基极少,而加入的戊二醛分子数相对地多,当戊二醛中的一个醛基与酶分子上的一个氨基结合后,则余下的一个醛基再与另一酶分子上的氨基作用的可能性极少,故很少产生酶与酶间的偶联。当去除未作用的戊二醛后,已醛化的酶与抗体作用而成为结合物〔幻,但这一方法标记效果也并不理想。另一类系用过碘酸钠氧化酶分子中的含糖部分使酶本身产生多个醛基,酶的活性中心未受影响或影响不大,而醛化了的酶再与待标记物作用即可获得结合物。这一方法由Nakane等首创〔3,,其特点是标记效果高而所得的结合物分子量较大。上述方法除标记效果较差的戊二醛一步法外,操作均较复杂。骆加里等(198劝〔4J报道了HRP标记抗原和抗体的简易方法,并将戊二醛二步法与过碘酸钠法结合起来试图获得更好的标记效果,但结果表明,戊二醛一过碘酸钠法不如甲醛一过碘酸钠法好。为了阐明这一原因并进一步提高标记效果,探讨了过碘酸钠在氧化HRP时的若干条件及结合中的某些问题,并在这一基础上,建立了简易、稳定、高效的方法。材料和方法HRP东风生化试剂厂1976年产品,RZ一2.78;SigmaV工,RZ一3.1;或用戊二不文195昌年9月2盛日收到。“本项研究得到联合国开发计划署,世界卫生组织疟疾、血吸虫病、带病研究培训特别规划的部分文持。丝虫病合作中J时世界银行/世界卫生组织热6期过碘酸钠氧化辣根过氧化物酶(HRP)中的若干问题及高效果的标记方法65了醛二步法标记后回收的游离酶。羊抗兔工gG的抗体系用亲和层析法获得的冻干材料,加生理盐水溶解至10mg/迎1。荀萄球菌A蛋白(SPA)购自上海生物制品研究所。用生理盐水配成smg/m1。乙二醇一氛化钠溶液称取29从Cl,加2.3二1乙二醇,再加水至loml,可长期保存。所用的化学试剂为分析纯或化学纯级,水为蒸馏水。标记效果的考核方法即一般所用的ELISA法,先以1:200的血吸虫虫卵抗原包被40井的聚苯乙稀板,继以1:200稀释的正常兔和血吸虫病病兔血清分别加入各井中,再将各批所得的各种结合物以1:6400开始作倍比稀释,与各种不同稀释度的结合物作用,最后以邻苯二胺一HoO。系统显色30分钟后终止反应。用EL工SA一Reader(Dynatech)测定各井的光密度(OD)值,当OD达1、2时即作为该结合物的终点。终点在1:640的稀释度时,定为1十,在1:12800时定为2十。依次类推,即终点每提高一个倍比稀释度即增加一个“十”酶标记血吸虫虫卵抗原结合物的考核方法基本同上。但包被物是兔抗虫卵抗原的抗体(20灿g/ml),再与不同稀释度的结合物作用,然后显色,读取OD。一般标记方法取HRP10mg/ml浓度的溶液1份,加0.06MNaIO4水溶液1份,于4oC氧化30分钟后加入含有2外Na01的0.4M乙二醇溶液1份,室温氧化30分钟,加冰冷无水乙醇12份混合,1500rpm离心10分钟,倾去上层液并倒置试管于滤纸上,加4份蒸馏水溶解沉淀(即醛化酶),几以每IngHRP加2mg抗体的比例,加入抗体溶液,再以pH9.6的0.SM碳酸盐缓冲液调节pH至9左右,于4oC放置16、24小时,加10mg/ml的KBH4水溶液0.1、0....
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