《生物工程进展》2000,Vol.20,No.3分离纯化中蛋白质的不稳定性及其对策冯小黎金业涛苏志国3(中科院遗传所人类基因组中心,北京100101)(3中科院化工冶金研究所生化工程国家重点实验室,北京100080)摘要分离纯化出高纯度有生物活性的蛋白质一直是一项艰巨的工作。在基因工程药物蛋白质的生产中,收率低和纯度低是亟待解决的关键问题。这里除了生物组份复杂、难以分离外,许多目标蛋白质自身活性的丧失也是一个重要原因。由于药物蛋白质昂贵的市场价格,回收率稍有提高就有可能带来巨大的经济效益,所以,有关蛋白质在分离纯化中的失活及其对策在近年来受到了极大的关注。1997年第十届欧洲生物技术大会上,蛋白质的稳定被单独列为一个专题。1999年在加拿大召开的第九届生物产品回收技术会议也对蛋白质的稳定性进行讨论。目前重点探索的是蛋白质失活的机制,采取相应的对策以保护活性,并在分离纯化中采用高效的分离纯化技术缩短操作周期,提高产物的活性回收率。关键词蛋白质稳定性分离纯化1蛋白质失活的机制蛋白质的三维结构是由疏水相互作用、静电相互作用、氢键、范德华力这些弱相互作用力及二硫键所维持的。它们的稳定自由能ΔGstab一般低于60KJ/mol,构象稳定性很低[1]。在分离提纯过程中,搅拌、升温、pH变化、盐浓度变化、添加表面活性剂或有机溶剂等是分离提纯难以避免的结果和所必需的操作,但这些结果和操作对大部分蛋白质都有造成结构变化的可能。甚至目标蛋白质自身浓度的变化也有可能造成三维结构的变化,导致失活。失活的蛋白质就成为杂质,不仅无用,还可能有毒。在分离提纯中蛋白质发生失活的机制有多种,概括起来有:11一级结构被破坏,导致三维结构的变化,造成失活:1)1肽键的酸水解和酶水解(在Asp的羧基侧链上最迅速)2)1Cys、Trp、Met的氧化3)1二硫键被还原,伴随β—消失和—SH形成4)1巯基与金属离子作用,形成硫醇盐5)1Asn和Gln脱酰胺作用6)1氨基酸的消旋作用7)1Pro的异构化21如果一级结构没有变化,三级或四级结构变化也可能导致失活,主要的机制有:1)1聚集(有时伴随分子和分子间二硫键的形成)2)1酶失去辅酶3)1寡聚蛋白质解离成单体4)1吸附于容器表面5)1不正确的折叠形式或形成错配的二硫键从动力学上讲,蛋白质在提纯过程中活性的丧失可能是由天然状态N经过一系列相对稳定的中间态U1,U2...而最终达到变性状态D[3]:NU1U2⋯D一些蛋白质处于中间状态时仍具有部分活性,是一个可逆过程,而成为变性态则有的是可逆的,有的是不可逆的。111蛋白质结构中影响稳定性的重要因素疏水相互作用对维持蛋白质的天然结构起重要的乃至决定性的作用[4]。Yatani等人证实蛋白质的稳定性与疏水性之间在一定的关系。而疏水性取决于蛋白质分子内部疏水性氨基酸的个数[5]。Mozhave等分析了嗜热酶的稳定性为什么比中温酶稳定性高的原因,结果表明[6],嗜热酶分子内部疏水性氨基酸含量高,具有更紧密的疏水核。氢键和离子键对稳定性也有作用。Pace等人发现[7],氢键对小分子蛋白质具有与疏水作用相同的甚至更高的稳定作用[8]。许多研究者证实[9]嗜76热酶复杂结构中具有更多的盐桥。但是对一个球蛋白来说,平均150个氨基酸残基中只有一个盐桥处于内部,其它都在分子表面。因此,参与稳定蛋白质的可能是处于分子表面的那些离子键[10]。蛋白质分子内二硫键数量的增加将提高蛋白质的稳定性[8,9]。此外,Ca2+、Mg2+、Zn2+和其他一些离子对某些蛋白质尤其是嗜热酶能起稳定作用。这种稳定作用是通过阳离子与蛋白球体中不稳定部分的结构而获得的,特别是与多肽链弯曲处的结合使蛋白质的总体结构更紧密、结实[11]。Hinz等人认为短距离范德华力对形成紧密堆积的核有很大贡献[8]。112环境因素对蛋白质稳定性的影响通常,蛋白质在其天然细胞或体液环境中是最稳定的。但是在分离纯化过程中,原来所存在的稳定环境如氧化还原势、结合蛋白、折叠酶、分子伴侣、稳定因子和膜等在纯化过程中不复存在。失活的可能性大增加。此外,蛋白质在提纯过程中其浓度与体内天然的不同。因此,环境因素是造成蛋白质在分离纯化中不稳定的一个重要因素。11211蛋白质的化学不稳定性在一定溶液条件下蛋白质的一些基团会发生化学反应。脱氨基[12]和氧化[13]是两个最常...
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