猪瘟间接血凝抗体检测试验一、原理：用已知血凝抗原检测未知血清抗体的试验，称为正向间接血凝试验（IHA）。抗原与其对应的抗体相遇，在一条件下形成抗原—抗体复合物。但这种复合物的分子团很小，肉眼看不见。将抗原吸附（致敏）在红细胞表面，制成猪瘟血凝抗原，用于检测免疫动物血清中的猪瘟抗体水平。这种经过猪瘟抗原致敏的红细胞与猪瘟抗体相遇，红细胞便出现清晰的凝集现象。二、主要组分：1．猪瘟血凝抗原5ml/瓶，5瓶/盒；2．猪瘟阳性对照血清0.5ml/管，1管/盒；3．猪瘟阴性对照血清0.5ml/管，1管/盒；4．稀释液50ml/瓶，2瓶/盒；5．封板膜10张/盒。三、试验器材：1．96孔110°V型医用血凝板；2．8道或12道移液器；3．微量振荡器。四、物理性状：1．抗原摇匀呈棕红色（或咖啡色），静置后，血球逐渐沉入瓶底；2．阴性对照血清淡黄色清亮稍带粘性的液体；3．阳性对照血清微红或淡黄色稍浑浊带粘性的液体；4．稀释液淡黄或无色透明液体，低温下放置，瓶底易析出少量结晶，在水浴中加温后即可全溶，不影响使用。五、作用与用途：用于检测猪瘟疫苗免疫动物血清抗体效价。六、用法与判定：1、用法1.1加稀释液在血凝板上1～7排的1～10孔、第8排的1～4孔和第5～7孔；加稀释液50μl/孔。1.2稀释待检血清待检血清使用前，需经过56℃水浴灭活30分钟，取待检灭活血清样品50μl，分别加入反应板1～6排的第1孔中，与稀释液混匀后，吸取50μl，加于第2孔中，依次作2倍系列稀释至第10孔，第10孔混匀后取出50μl弃去。1.3稀释阳性对照血清在血凝板的第7排第1孔加阳性血清50μl，2倍系列稀释至第10孔，混匀后从该孔取出50μl丢弃。此时被检血清和阳性血清的稀释倍数依次为1:2～1:1024。1.4稀释阴性对照血清在血凝板上的第8排第1孔加阴性血清50μl，对倍稀释至第3孔，混匀后从该孔取出50μl丢弃。此时阴性血清的稀释倍数依次为1:2、1:4、1:8。第5～7孔为稀释液对照，每孔仅加入50μl稀释液。1.5加血凝抗原血清稀释孔和稀释对照孔加血凝抗原（充分摇匀，瓶底应无血球沉淀）25μl/孔。将反应板置微型振荡器上震荡2～3分钟或用手依次四边轻拍，直至血球分布均匀。封板膜封板，室温下静置2～3小时判定结果，也可延至翌日判定。2、判定以呈现“＋＋”血凝反应的血清最高稀释度作为该血清的间接血凝抗体效价。血凝反应强度表示如下：“＋＋＋＋”红细胞全部凝集，形成一层均匀膜，布满整个孔底。“＋＋＋”红细胞在孔底形成一层薄膜，面积比前者略小。“＋＋”红细胞在孔底形成薄膜凝集，边缘松散或呈锯齿状。“＋”红细胞在孔底呈稀薄、散在、少量凝集，孔底有小圆点。“±”红细胞沉于孔底，但周围不光滑或中心有空斑。“—”红细胞完全沉于孔底，呈光滑的圆点。当阳性血清抗体效价≥1:256、阴性血清抗体效价≤1:8、稀释液对照孔无自凝现象时，试验成立。接种猪瘟疫苗的猪群免疫抗体效价≥1:16为免疫合格。七、注意事项：1．为使您的实验获得正确结果，请您在实验前仔细阅读本说明书；2．收到本试剂盒时，应立即打开包装，取出血凝抗原瓶，用力摇动，使粘附在瓶盖上的红细胞摇下，否则易出现沉渣，影响使用效果；3．勿用90°和130°血凝板，严禁使用一次性血凝板，以免误判结果；4．严重溶血或严重污染的血清样品不易检测，以免发生非特异性反应；5．每次检测只做一份阴性、阳性和稀释液对照；6．用过的血凝板应及时在水龙头下冲净血球。再用蒸馏水或去离子水冲洗2次，甩干水分放37℃恒温箱内干燥备用。检测用具应煮沸消毒，37℃干燥备用。血凝板应定期浸泡在洗液中也可浸泡在5%盐酸液内，48小时取出后清水冲净。
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