分类号密级UDC编号中国科学院研究生院博士学位论文丙酮丁醇梭菌遗传操作系统的改造董红军指导教师李寅研究员中国科学院微生物研究所申请学位级别博士学科专业名称微生物学论文提交日期论文答辩日期培养单位中国科学院微生物研究所学位授予单位中国科学院研究生院答辩委员会主席ADissertationSubmittedtotheCommitteeofInstituteofMicrobiology,ChineseAcademyofSciencesforPh.D.DegreeImprovementofGeneticManipulationSystemforClostridiumacetobutylicumByHongjunDongDirectedbyProf.YinLiMay2011,Beijing摘要I摘要丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)是一种工业上用于生产溶剂(包括丙酮、丁醇、乙醇)的细菌。由于丁醇是一种潜在的可替代汽油的生物燃料，丙酮丁醇梭菌近年来引起了广泛的关注。对丙酮丁醇梭菌的遗传学研究及菌株改造是实现其产业化的一个基础工作，但是由于丙酮丁醇梭菌是严格厌氧的革兰氏阳性细菌，虽然目前已经发展出一些遗传操作方法，但是仍存在着不少问题，限制了遗传操作的效率。本论文就目前丙酮丁醇梭菌遗传操作过程中所遇到的一些基本问题进行了研究，主要包括：1)解除丙酮丁醇梭菌中的限制修饰系统。丙酮丁醇梭菌细胞内存在着严格的限制修饰系统，可以降解外源DNA，目前的解决方法是对要进行转化的DNA进行甲基化修饰(使用来自芽胞杆菌噬菌体Ф3TI甲基化酶)。本论文选定可能编码二型限制性内切酶Cac824I的基因CAC1502为靶点，通过二型内含子基因敲除技术对其进行了失活，得到了突变体菌株SMB009，使用该菌株进行转化时，使用的DNA无需预先进行DNA甲基化修饰即可实现转化。2)实现丙酮丁醇梭菌的有氧转化。因为丙酮丁醇梭菌对氧气敏感，所以对其进行操作的过程需要在厌氧条件下(厌氧箱)进行。为了能够使丙酮丁醇梭菌在空气中进行操作，我们以SMB009为出发菌株，失活了其中的氧气响应负调控蛋白编码基因CAC2634，得到的突变体菌株SMB012可以实现在空气中进行转化操作，使得整个操作过程可以不依赖于厌氧箱，且节约时间近40%。3)发展了适用于丙酮丁醇梭菌的诱导型表达系统。我们以氯霉素抗性基因cat的启动子为模型，通过引入不同组合的四环霉素抗性基因操纵子调控序列tetO，发展出了pGusA2-2tetO1和pGusA2-tetO2/1两个系统，经100ng/ml脱水四环霉素(aTc)诱导3小时后，报告基因表达的β-葡萄糖苷酸酶(GusA)诱导倍数分别是120倍和149倍。丙酮丁醇梭菌遗传操作系统的改造II本论文通过基因工程手段提升了丙酮丁醇梭菌的遗传可操作性，提供了可接受非甲基化DNA并且可在空气中进行转化的丙酮丁醇梭菌工程菌株，以及适用于丙酮丁醇梭菌的诱导型表达系统。这些工作的开展为把丙酮丁醇梭菌改造成为实验室中易于操作的模式生物奠定了基础。关键词：丙酮丁醇梭菌、遗传操作、限制修饰系统、有氧转化、诱导型表达系统AbstractIIIAbstractClostridiumacetobutylicumisknownastheproducerofsolvents(acetone,butanolandethanol).Becauseoftheexcellentcharacteristicsofbutanolasbiofuel,manyattentionswerepaidontheresearchofC.acetobutylicum.Tomaketheproductionprocesseconomicallyfeasible,strainimprovementisanessentialstep.However,C.acetobutylicumisdifficulttomanipulatebecauseitisanaerobicandGram-positive.Inthisdissertation,thesubjectistosolvesomeproblemsinthegeneticmanipulationprocess.Thecontentmainlycontainsthreeparts:1)ReleaseoftheRestriction-Modificationsystem(RMsystem)inC.acetobutylicum.Typically,theDNA,whichwillbeintroducedintoC.acetobutylicum,needstobemethylatedbyФ3TImethyltransferasefromthephageФ3TofBacillussubtilis,becauseofthepresenceofRMsystem.AgeneCAC1502putativelyencodingthetypeIIrestrictionendonucleaseCac824IwasidentifiedfromthegenomeofC.acetobutylicumDSM1731,anddisruptedusingtheClosTronsystembasedongroupIIintroninsertion.TheresultedstrainSMB009lostthetypeIIrestrictionendonucleaseactivity,andcanbetransformedwithunmethylatedDNAasefficientaswithmethylatedDNA.2)Electrotr...
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