细菌人工染色体文库的构建与鉴定周向梅，关伟军(1．中国农业大学动物医学院，北京100094；2．中国农业科学院畜牧研究所，北京100094)摘要：细茵人工染色体是继噬茵体、黏粒、噬茵体人工染色体、酵母人工染色体等栽体系统之后发展起来的DNA载体系统，以其容量大、遗传特性稳定、嵌合体少、插入片段易回收、操作简便等优点，而被广泛应用于基因组较大的真核生物基因组研究中，并发挥着前所未有的重要作用。因此本文概括性地阐述了细茵人工染色体的发展，以及利用此栽体构建基因组文库的机理和程序及其鉴定方法。关键词：细茵人工染色体；文库构建；鉴定中图分类号：$188文献标识码：A文章编号：1008—0864(2003)03—0040—04由于真核生物基因组十分庞大，因此对于真核基因组的研究，必须有一系列能容纳大片段基因组DNA的载体，最初人们构建真核基因组文库大多使用入噬菌体(kphage)和黏粒(cosmid)作为克隆载体，二者容纳外源DNA片段的最大能力分别是25kb和45kb。尽管这两种系统克隆效率高，但由于插入的DNA片段较小及克隆的DNA片段不稳定，因此限制了它们在染色体步行(chromosomewalking)中的应用l_1]。1987年酵母人工染色体(yeastartificialchromosome，YAC)构建成功_2]，这种载体可插入上千kb左右的外源DNA，但利用YACs有嵌合、重排和缺失现象，其插入片段的分离较难，转化效率低等缺陷。为了克服YAC的上述不足，又相继出现了3个候补克隆载体，如噬菌体P1克隆系统(bacterio—phageP1clones)_3]，P1衍生人工染色体(P1一derivedArtificialchromosome，PAC)l_4和细菌人工染色体(Bacterialartificialchromosome，BAC)_5等载体系统，其中目前被认为比较理想的是细菌人工染色体，它是1992年以来发展起来的一种新型克隆载体，用于构建人、动物、植物核基因组DNA大片段插入文库。由于它具有以上载体系统无可比拟的优点而迅速得到广泛应用。基因组文库是用重组DNA技术将某种生物细胞的核DNA的全部片段随机地连接到基因载体上，再转移至适当的宿主细胞中，通过细胞增殖而形成的各个片段的无性繁殖系的总集。其目的在于便于纯化、贮存和广泛深入的分子生物学研究。构建基因文库时，一个最重要的指标就是它能在多大程度上代表起始材料，即它是否能覆盖所有原初序列。如果某些序列，如缺少限制性酶切位点的重复序列未被克隆，这样的文库就不具代表性。同样如果文库中未能含有足量的克隆，则极有可能会丢失某些基因。因此，文库建成后采用行之有效的鉴定方法来验证其质量也是至关重要的。本文就细菌人工染色体的发展，文库的构建机理和程序及鉴定方法进行概括性地论述，试图对相关研究提供参考。1细菌人工染色体(BAC)载体的构建1．1人工染色体的发展DNA克隆技术是分子生物学研究中重要的技术手段之一。自1973年Cohen_6构建了第一个质粒载体Psc101以来，越来越多的克隆载体相继涌现，使得克隆载体的整体结构和克隆效率有了很大改善。基于生物体的许多重要性状牵涉到复杂的生理生化反应系列，在大多数情况下受多基因或基因簇的控制，往往与几百一几万kbDNA片段密切相关。特别是庞大基因组的物理图谱和基因图谱的绘制也涉及到大片段DNA的研究，因此，提高载体的容纳量，一直是克隆载体的重要发展方向之一。随着脉冲交变电泳技术的发展_7以及基因组研究的日益深入，对容量大，并且能独立、稳定存在和遗传的人工染色体的研究已得到了迅速的发展。所谓人工染色体，是指一类能在生物细胞中独立、稳定存在和遗传的人工重组DNA分子，它至少应具备三种功能元件的类似组份：复制起始点(originofreplication)，着丝点(centromere)和端粒(telomere)。1983年，Murray_8把酵母染色体的着丝点、自主复制序列和端粒三者连接在一起，构建成了第一个人工染色体，称为酵母人工染色体(yeastartificialchromosome，YAC)。在此基础上，Burkel_2构建了第一个YAC载体，它可插入上千kb左右的外源DNA，是大片段基因组文库构建、染色体收稿日期：2003—05—13作者筒介：周向梅，女，1973年生，兽医师，在读博士；主要研究方向为动物基础病理。维普资讯http://www.cqvip.com步移或登陆、物理图谱构建和基因组织结构分析等的有力...
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