口研究与综述RT—PCR检测高致病性猪蓝耳病方法的探讨杨芳1崔明秀2张巧花2’(1．宁夏盐池县动物卫生监督所751500，2．宁夏盐池县动物疾病预防控制中心751500)高致病性猪蓝耳病是由猪繁殖与呼吸综合征(PorcineReproductiveandRespiratorySyndrom，PRRS)病毒变异株引起的急性高致死性疫病，是目前流行广、危害非常严重的传染病，目前被我国定为二类传染病，由于其可造成母猪繁殖障碍、仔猪及育肥猪的高死亡率，尤其是可引起发病猪免疫抑制机能障碍，因此可给养猪业造成巨大的经济损失。目前。检测PRRSV感染的方法已有多种，包括病毒分离、抗原检测和抗体检测等，这些方法有的操作比较繁琐，有的带有一定的主观性，准确度不高。应用RT-PCR(世纪元亨试剂盒，由北京元亨公司生产)方法操作简便，特异性强，对临床样品的快速诊断及流行病学调查具有很强的实用价值。本实验就我县一些规模养猪场和一些个体养猪专业户饲养的猪突然出现以高热、食欲废绝、耳朵末梢发紫等，且临床发病率、死亡率高为特征的疾病，对病死猪进行了无菌采样，送实验室进行了检测，最终利用RT-PCR的方法检测出这次疫病流行主要是感染了高致病蓝耳病病毒所致，为疫病的有效防控争取宝贵的时间。1材料与方法1．1材料无菌采集盐池县20户规模养猪户和部分散户共计40份病料，其中有部分实质脏器包括肺脏、脾脏、淋巴结、脑等组织及发病猪的血清进行检测。北京元亨试剂盒。阳性对照、变性液、醋酸钠溶液、酚，氯仿，异戊醇混合液(50：49：1)、异丙醇、75％乙醇、(DEPC)处理的灭菌去离子水、RNA酶抑制剂、反转录反应液、反转录酶、PCR反应液、TaqDNA聚合酶(0．5单位，微升)、矿物油、50倍TAE电泳缓冲液、上样缓冲液pH值为7．2磷酸盐(PBS)液的配制。①配制25×PB：称量2．74克磷酸氢二钠和0．79克二水磷酸二氢钠加蒸馏水至100毫升。②配制1×PBS：量取40毫升2．5×PB，加入8．5克氯化钠，加蒸馏水至l000毫升。③用氢氧化钠或盐酸调pH值至7．2。灭菌，然后在4qC保存。50倍TAE电泳缓冲液的配制。称量三羟甲基氨甲基烷(Tris)242克，冰乙酸57．1毫升，0．5摩尔，升乙二铵四乙酸二钠溶液(pH值为8．0)100毫升加灭菌双蒸水至l000毫升。用时用灭菌双蒸水稀释使用。#r'【-I／j工X7i=J唧‘1T，于J、ⅡF注射器、1．5毫升经焦碳酸二i(EP)、0．2毫升薄壁PCB管，作者简介：杨芸(1974-)，女，隔养殖技术顾问2009．8性管升锥形瓶、吸头(10—50微升、20-200微升、200—1000微升)、灭菌双蒸水。1．2主要仪器设备电子天平，BS-210S，产地德国；台式冷冻高速离心机，IECMicrolite；二级生物安全柜，HFSAFE-TE；PCR扩增仪，PTC一200，产地美国；电泳仪，Dyy-2c，北京六一仪器厂生产；电泳槽，Dyy-2e，北京六一仪器厂生产；紫外凝胶成像仪，GDS-8000System；-70。C冰箱，MDF-328E，产地日本；微波炉，格兰仕；-20。C冰箱，BD-255LT／100LT，中国青岛；组织研磨器；单道移液器；计时器。1．3方法细菌学检查。将无菌采集到的心、肝、脾、淋巴结等病料制成涂片，革兰氏染色后，置于显微镜下检查；随后将上述脏器接种子普通营养培养基、麦康凯培养基、血琼脂培养基、SS培养基和厌氧培养基上进行培养。‘R卜PCR检测。组织样品及待检血清的处理。称取猪组织(取肺、脑、扁桃体、脾脏共0．5克)于研磨器中，加少量的石英砂进行研磨，再加入1．5毫升pH值为7．2的PBS液研磨，待匀浆后转至1．5毫升EP管中，8000转，秒离心10分钟，取上清液100微升于1．5毫升EP管中，加入300微升变性液，混匀；全血样品处理，取血清100微升置1．5毫升EP管中，加入300微升变性液，混匀；标准阳性与标准阴性处理方法与待检血清的操作程序一样。病毒RNA的提取。取已处理的样品，分别做好标记，每管依次加入醋酸钠溶液(pH值为4．0)30微升、酚，氯仿，异戊醇混合液300微升，颠倒10次，混匀，置-20。C冰箱中10分钟，4℃离心，12000转，秒，离心15分钟。取300微升上清液置于l，5毫升EP管中，加入300微升异丙醇，混匀，置一20℃冰箱中30分钟。取出置离心机中4℃离心，12000转，秒离心20分钟。弃上清液，沿管壁缓缓滴入l毫升75％乙醇，轻轻旋转一周后倒掉，将离心管倒扣于吸水纸上1分钟，自...
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