DOI:10.3724/SP.J.1096.2010.01161毛细管凝胶电泳紫外检测核酸灵敏度连冬生*�张相年�贺宝霞�赵树进�韩丽萍(广州军区广州总医院药剂科,广州510010)摘�要�以已知浓度的DNAMarker为标准样品,常规压力进样,电动进样,柱头场放大及联合使用基质场放大和柱头场放大等方法进行CGE�UV分析,对比不同进样方法的检测灵敏度。以聚合酶链式反应(PCR)后的高盐DNA样品验证方法的可靠性。当DNA样品稀释达40万倍,与电动进样和压力进样相比,在对峰形和峰宽无明显影响下,将电动进样的时间延至420s,三羟甲基氨基甲烷�盐酸缓冲液(TE)浓度降低至1.5%,柱头场放大灵敏度分别提高了约28和90倍;联合使用基质场放大和柱头场放大后,灵敏度分别提高3760和12000倍。DNA的检出限达0.1�g/L(S/N=3,CGE�FASI�UV)。同时以本法分析PCR后的DNA产物获得了极高的灵敏度(分别比普通的压力进样和电动进样提高50477倍和33354倍)。本实验采用基质场放大和柱头场放大联用,方法操作简单,灵敏度高,适用于高盐微量的DNA样品分析。关键词�脱氧核糖核酸;毛细管电泳;基质场放大;柱头场放大;聚合酶链式反应产物�2009�09�03收稿;2010�01�30接受*E�mai:lmytough@163.com1�引�言1981年,Jorgenson等[1]使用第一根熔融石英毛细管进行CZE分离并获得4�105理论塔板的高效率。1994年,Woolley等[2]首先报道了使用芯片CE分离DNA之后,CE分析技术因其具有微量、自动化、快速及高通量等优点得以迅速发展[3],应用范围日益扩大。然而在核酸分析方面,由于DNA双键较弱的紫外吸收值,常规的紫外检测器的灵敏度难以满足低浓度DNA的分析要求,影响了CE技术在DNA分析的应用。荧光检测虽能极大提高灵敏度,但存在荧光检测器价格较贵、样品需荧光标记或嵌合荧光染料等问题,还难以在实际分析中普及应用。近年来,提高CE分检测灵敏度的研究取得了良好的进展,如场放大电动堆积注射(FASI),大量样品堆积(LVSS),pH介导的样品堆积[4,5],临界移动化学反应边界方法[6],动态pH接合[7],临态等速电泳浓集[8],无限量样品电动堆积注射[9]和Sweeping浓集[10]等技术,极大地提高了常规CE�UV检测灵敏度,如使黄素单核苷酸,黄素腺嘌呤二核苷酸的检测灵敏度提高1200倍[11],可使麦斯明和新烟碱的检测灵敏度提高1400倍[12]。特别是场放大进样技术,操作简便,应用于检测多奈哌齐[13]、苏灵大及其在血浆中的代谢物[14],尿液单氨酸[15],草酸盐[16]等,均能大幅度提高检测灵敏度。应用于核酸分析,检出限也达到7mg/L[17]。最近,Chen等[18]以EB为嵌合染料,将DNA的检出限降至0.09�g/L(CGE�tITP�LIF)。而本实验将基质场放大和柱头场放大技术结合,应用于DNA片段的分析,进一步提高了灵敏度。仅使用CGE�UV,将检出限降至0.1�g/L,与LIF接近,为CE�UV进行微量核酸的分析提供了可行的方法。2�实验部分2.1�仪器与试剂P/ACEMDQ毛细管电泳仪(Beckman公司);涂层毛细管(内径100�m,总长度64cm,有效长度53.8cm);聚合酶链式反应仪(PCR,美国PE公司);PCR管,紫外分光光度计(Beckman公司)。0.5g/LDNAmarker(Fermentas公司);含10个DNA条带,分别为100,200,300,400,500,600,700,800,900和1000,各条带的含量分别为40,40,40,40,115,45,45,45,45和45�g/L。TE(10mmol/Ltris�HC,lpH8,1mmol/LEDTA)、凝胶和凝胶缓冲液(Beckman公司);所用水和凝胶缓冲第38卷2010年8月�����������分析化学(FENXIHUAXUE)�研究报告ChineseJournalofAnalyticalChemistry�����������第8期1161~1166液均先通过0.45�m微孔滤膜除杂后,再通过1min超声波除去气泡。DNA提取试剂盒(广州天根有限公司);Taq聚合酶(Takala公司);聚合酶链式反应(PCR)引物(F:5��CATCAGTTAGTAGACAGATGA�3�,R:5��GGTCCAAACAGGGAAGAAATA�3�,上海英骏公司合成)。SspI内切酶(NEB公司);琼脂糖(广州威佳有限公司)。所用试剂为分析纯,水为去离子水。2.2�实验方法用移液枪取1�L标准DNAmarker,配制浓度为50000,5000,500,50,5.0和1.25�g/L的供试品,根据实验需要用去离子水和TE进行调整溶液的离子强度。PCR及酶切:(1)提取血液基因组DNA(天根DNA提取试剂盒),紫外分光光度计检测DNA浓度及纯度;(2)PCR条件:50�L加入10�PCR缓冲液5...
VIP
