基因克隆及蛋白表达VIP专享VIP免费

基因克隆及蛋白表达基因克隆及蛋白表达细胞生物学教研室细胞生物学教研室李丰李丰研究某一目的基因功能一般策略研究某一目的基因功能一般策略目的目的DNADNA获得来自三条途径获得来自三条途径::1.1.genomegenome上的特定区域或序列上的特定区域或序列2.2.含有目的含有目的DNADNA的质粒的质粒3.3.从从cDNAcDNA文库中扩增单个已知文库中扩增单个已知cDNAcDNA获得目的获得目的DNADNA构建含目的构建含目的DNADNA质粒质粒转化细菌转化细菌蛋白表达纯化蛋白表达纯化转染真核细胞转染真核细胞蛋白定位、表达及表型变化蛋白定位、表达及表型变化第一部分第一部分PCRPCR聚合酶链反应（聚合酶链反应（PCRPCR）技术）技术聚合酶链式反应聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction(PolymeraseChainReaction，，PPCR)CR)是是2020世纪世纪8080年代后期由年代后期由K.MullisK.Mullis等建立的等建立的一种体外酶促扩增特异一种体外酶促扩增特异DNADNA片断的技术。片断的技术。PCRPCR是利用针对目的基因所设计的是利用针对目的基因所设计的一对特异寡核一对特异寡核苷酸引物苷酸引物，以目的基因为模板进行的，以目的基因为模板进行的DNADNA体外合体外合成反应。成反应。PCRPCR技术具有灵敏度高，特异性强，操作简便等技术具有灵敏度高，特异性强，操作简便等特点。目前已广泛应用于分子生物学的各个领域。特点。目前已广泛应用于分子生物学的各个领域。一、一、PCRPCR实验原理实验原理一、一、PCRPCR实验原理实验原理二、二、PCRPCR的反应体系的反应体系1.PCR1.PCR引物引物（（11））primerprimer长度：长度：18-30bp18-30bp引物短引物短特异性降低特异性降低引物长引物长影响产物生成影响产物生成（（22））primerprimer浓度：浓度：0.1-1.00.1-1.0umol/Lumol/L浓度过高浓度过高错配、引物二聚体增加错配、引物二聚体增加浓度过低浓度过低PCRPCR效率降低效率降低二、二、PCRPCR的反应体系的反应体系2.2.缓冲液缓冲液KClKCl、、Tris-ClTris-Cl、、MgClMgCl22，，MgMg2+2+：：1.51.5～～2.0mM2.0mMMgMg2+2+::DNADNA聚合酶聚合酶活性活性PCRPCR产量产量MgMg2+2+:PCR:PCR反应特异性反应特异性二、二、PCRPCR的反应体系的反应体系3.DNA3.DNA聚合酶聚合酶TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶LADNALADNA聚合酶聚合酶PrimeSTAR(PyrobestDNAPrimeSTAR(PyrobestDNA聚合酶聚合酶))PfuDNAPfuDNA聚合酶聚合酶TaqDNApolymeraseTaqDNApolymerase5‘5‘3‘3‘5‘3‘3‘5‘5’5’3’DNA3’DNA聚合酶活性。在模板和引物存在的条聚合酶活性。在模板和引物存在的条件下，以件下，以dNTPdNTP作为底物，沿作为底物，沿5’5’3’3’方向合成与方向合成与模板互补的模板互补的DNADNALATaqDNAPolymeraseLATaqDNAPolymerase1.5’1.5’3’DNA3’DNA聚合酶活性；聚合酶活性；2.3’2.3’5’DNA5’DNA外切酶活性。外切酶活性。Pyrobest&pfuDNAPolymeraPyrobest&pfuDNAPolymeraseseTaqDNATaqDNA聚合酶活性聚合酶活性3’3’5’5’外切酶活性，可信度极高外切酶活性，可信度极高PCRPCR产物为平滑末端产物为平滑末端PCRPCR的反应体系的反应体系4．dNTP:50-200umol/L5.模板DNA（1）单链DNA（2）双链DNA（3）浓度：基因组DNA：1ug质粒DNA：10ng三、基本操作步骤三、基本操作步骤1.变性变性(denature)(denature):95℃高温下,双螺旋氢键断裂,双链DNA解链成为单链DNA2.退火退火(annealing)(annealing):两条引物与模板DNA扩增区域的两端按碱基互补配对结合.3.延伸延伸(extension)(extension):在4种dNTP底物及Mg2+存在条件下,TaqDNA聚合酶在72℃下,将单核苷酸按碱基互补配对原则从引物3‘端掺入,,使引物沿5’→3’方向延伸合成新股DNA四、条件优化四、条件优化1.1.变性变性:95℃:95℃变性变性20-30s,20-30s,即可使各种即可使各种DNADNA完完全变性。全变性。2.2.退火退火::引物与模板退火温度由引物长度和引物与模板退火温度由引物长度和GC%GC%决定决定,,退火温度一般应比退火温度一般应比TmTm值低值低4-12℃4-12℃为宜为宜,,退火时间一般为退火时间一般为20-40s20-40...