流式细胞术原理流式细胞术原理//用途用途//制样要制样要求求张波（药理室）15009931220bozhang_lzu@sina.com流式细胞仪是什么仪器，什么时候会用到？2009年1月20日1月23日2月2日流式细胞术流式细胞术（FlowCytometry,简称FCM）是一种可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常是细胞）的多项特性的技术，同时可以对特定群体加以分选研究对象为生物颗粒，如各种细胞、染色体、微生物、及人工合成微球等研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量BDFACSCalibur流式细胞仪可检测到的细胞参数•非荧光信号颗粒度细胞大小=前向角散射光（FSC）细胞相对大小及其表面积=侧向角散射光（SSC）细胞颗粒度及细胞内细胞器的相对复杂性血液涂片外周全血细胞散射光双参数点图ReviewQuestionDeadcellsareknowntobesmallerandtoexhibitmoreinternalcomplexitythanlivecells.Whichofthepopulationsonthisplotwouldyouexpecttobedead?流式细胞仪可检测到的细胞参数•荧光信号R1File:4AcquisitionDate:06-Mar-03QuadEvents%GatedXMeanYMeanUL2542.4037.47461.36UR106710.08816.86468.89LL529149.9819.574.41LR397537.55418.809.87图AnnexinV/PI双标记分析细胞凋亡和坏死Two-ColorCellAnalysisWhichofthethreepopulationshasthemostAbAbindingsites?AbAAbB样本处理细胞悬液的制备•细胞悬液：–分离PBMC、PRP等：操作复杂，分离、离心步骤导致细胞特定群体丢失，并可能引入某些误差–直接使用外周血、骨髓：最接近生理状况，操作简便，样本用血量小–灌洗液、体腔积液–培养细胞、细胞系•实体组织：–病理组织：新鲜样本/石蜡包埋样本–针吸组织：新鲜样本•鞘液、洗液等：清洁无颗粒杂质（.22滤膜）植物样本的制作步骤一：选择合适的荧光染料•必须被流式细胞仪上所配备激光器所激发•激发光谱在仪器上滤光片能够接受范围内•荧光素光谱的重叠应当尽量减少OpticsLaserFluorochromeDetectorParameterFilterFITCFITCGFPGFPFL1FL1530/30530/30PEPEPIPIFL2FL2585/42585/42PerCPPerCPPerCP-CY5.5PerCP-CY5.5FL3FL3670LP670LPAPCAPCFL4FL4661/16661/16488nm488nm635nm635nm步骤二：染色•体积•温度•孵育时间•对照步骤三：数据收集和分析•画图•寻找目标细胞•调整仪器设置到合适的状态•我们可以得到怎样的结果？它们意味着什么？散点图密度图二维等高图直方图图报告中常见的几种流式细胞图仪器设置调节1.用未染色细胞调整仪器PMT电压开机需准备试剂•建议首次试机避免进行大量试验，仅需准备下列样品（1）NegativeControl（不加任何抗体）。（2）CD3-FITC（FL1单染）（3）CD19-PE（FL2单染）（4）CD3-FITC/CD19-PE（FL1/FL2双染）。2.用单染色的细胞调节仪器补偿关于同型对照•例：一个双色染色的实验抗体AFITC，抗体BPE对应的同型对照是IgG1FITC,IgG1PE那么需要准备的是阴性对照：细胞加上IgG1FITC,IgG1PE单阳性对照：FITC:细胞加上AbAFITC,IgG1PEPE:细胞加上AbBPE,IgG1FITC数据分析•设门•设定阴性与阳性群体的界限•确定阳性与阴性细胞群体•统计阳性或阴性细胞群体的百分率，平均荧光值，绝对数或抗体结合数
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