毕赤酵母常用培养基与载体一、毕赤酵母表达常用载体：典型的巴斯德毕赤酵母表达载体载体包含醇氧化酶－1（AOX1）基因的启动子和转录终止子（5'AOX1和3'AOX1），它们被多克隆位点（MCS）分开，外源基因可以在此插入。此载体还包含组氨醇脱氢酶基因（HIS4）选择标记及3'AOX1区。当整合型载体转化受体时，它的5'AOX1和3'AOX1能与染色体上的同源基因重组从而使整个载体连同外源基因插入到受体染色体上，外源基因在5'AOX1启动子控制下表达。毕赤酵母本身不分泌内源蛋白，而外源蛋白的分泌需要具有引导分泌的信号序列。而由89个氨基酸组成的酿酒酵母的分泌信号—α交配因子(α-factor)引导序列已经成功地引导了几种外源蛋白的分泌。分泌表达载体主要有：pPIC9，pPIC9K，pHIL-S1，pPICZαA，pYAM75P等。胞内表达载体主要有：pHIL-D2，pA0815，pPIC3K，pPICZ，pHWO10，pGAPZ，pGAPZa(Invitrogen)，pPIC3.5K等。工程菌株Y11430，MG1003，GS115（AOX1），KM71，SMD1168。毕赤酵母宿主菌常用的有GS115和KM71两种，都具有HIS4营养缺陷标记。其中，GS115茵株具有AOX1基因，是Mut＋，即甲醇利用正常型；而KM71菌株的AOX1位点彼ARG4基因插入，表型为Muts，即甲醇利用缓慢型，两种菌株都适用于一般的酵母转化方法。多拷贝表达菌株的获得方式：与自主复制的质粒型表达载体不同，整合型表达载体的拷贝数可以有很大的变化。含多拷贝外源基因的表达菌株合成蛋白的量也较多。体内整合可通过高遗传霉素抗性，筛选可能的多拷贝插入；而体外整合可通过连接产生外源基因的串联插入。多拷贝表达菌株的获得方式有两种：一种是利用SDS-PAGE电泳、免疫杂交或菌落点杂交方法在大量的转化子中进行自然筛选。得到产量高的表达菌株。另一种在转化前将多个表达盒拷贝插入到单个载体中，而后再通过交换整合到受体染色体上。表达蛋白纯化方法：酵母系统表达的蛋白一般都具有活性，所以都采用较温和的纯化方式来纯化目的蛋白，分泌型表达的蛋白有利于纯化，可用硫酸铵沉淀，然后用离子交换，凝胶过滤层析，疏水层析等方法进一步纯化。具体的方法和操作应按所处理的目的蛋白的性质选择。二．毕赤酵母表达的培养基配制和用途2.1LB（Luria－Bertani）培养基：Tryptonl％YeastExtract0.5％NaCll％PH7.0制作平板时加入2％琼脂粉。121℃高压灭菌20min。可于室温保存。用于培养pPICZαA原核宿主菌TOP10F’时可加入Zeocin25ug/ml。2.2LLB（LowSaltLB）培养基：Tryptonl％YeastExtract0.5％NaCl0.5％PH7.0制作平板时加入2％琼脂粉。121℃高压灭菌20min。可于室温保存数月。用于培养pPICZαA原核宿主菌TOP10F’时，加入Zeocin25ug/ml，可以4℃条件下保存1～2周.2.3YPD（又称YEPD）YeastExtractPeptoneDextroseMedium，（YeastExtractPeptoneDextroseMedium，酵母浸出粉/胰蛋白胨/右旋葡萄糖培养基）Trypton2%dextrose(glucose)2%+agar2%+Zeocin100µg/ml液体YPD培养基可常温保存,是毕赤酵母的最基本培养基，琼脂YPD平板在4℃可保存几个月。加入Zeocin100ug/ml，成为YPDZ培养基，可以4℃条件下保存1～2周。2.4BMGY培养基Yeastextract1%Peptone2%磷酸钾缓冲液（pH6.0）100mmol/LYNB1.34%Biotin（4×10-5）%Glycerol1%毕赤酵母诱导表达前培养基，YNB和Biotin过滤除菌。培养24小时后，一般静置过夜，待酵母沉淀后倒掉BMGY培养基，改换BMMY培养基，进入诱导表达阶段。2.5BMMY培养基Yeastextract1%Peptone2%磷酸钾缓冲液（pH6.0）100mmol/LYNB1.34%Biotin（4×10-5）%methanol3%毕赤酵母诱导表达培养基，YNB和Biotion过滤除菌。摇瓶培养时每24小时之后加入3%的甲醇诱导，一般诱导72小时。2.6YPDS+Zeocin培养基（YeastExtractPeptoneDextroseMedium）：yeastextract1%peptone2%dextrose(glucose)2%sorbitol1M+agar2%+Zeocin100µg/ml不管是液体YPDS培养基，还是YPDS+Zeocin培养基，都必须存放4℃条件下，有效期1～2周。2.7MGYMinimalGlycerolMedium（最小甘油培养基）（34%YNB；1%甘油；4*10-5%生物素）。将800ml灭菌水、100ml的10*YNB母液、2ml的500*B母液和100ml的10*GY母液混匀即可，4℃保存，保存期为2个月。2.8MGYHMinimalGlycerolMed...
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