荧光光度分析荧光光度分析法法一、基本原理一、基本原理在紫外光或波长较短的可见光照射在紫外光或波长较短的可见光照射后，一些物质会发射出比入射光波长更后，一些物质会发射出比入射光波长更长的光长的光----------------荧光荧光。以测量荧光的强。以测量荧光的强度和波长为基础的分析方法叫做度和波长为基础的分析方法叫做荧光光荧光光度分析法。度分析法。1.1.荧光的定义荧光的定义假设分子在吸收辐射后被激发到假设分子在吸收辐射后被激发到SS22以上的某以上的某个电子激发单重态的不同振动能级上，处于较高振个电子激发单重态的不同振动能级上，处于较高振动能级上的分子，很快地（约动能级上的分子，很快地（约1010-12-12~10~10-14-14ss）发生）发生振动松驰，将多余的振动能量传递给介质而降落到振动松驰，将多余的振动能量传递给介质而降落到该电子的最低振动能级（该电子的最低振动能级（V=0V=0），后经由内转化），后经由内转化及振动松驰而降落到及振动松驰而降落到SS11电子态的最低振动能级，电子态的最低振动能级，处于处于SS11电子态的激发分子，其分子内的去活化作电子态的激发分子，其分子内的去活化作用有如下三种途径用有如下三种途径：：2.2.分子产生荧光的机理分子产生荧光的机理（（11）发生）发生SS11→S→S00的辐射跃迁而伴随荧光现的辐射跃迁而伴随荧光现象；象；（（22）发生）发生SS11→S→S00的内转化过程；的内转化过程；（（33）发生）发生SS11→T→T11的体系间窜跃。而处于的体系间窜跃。而处于TT11态的最低振动能级的激发分子，则可能发生态的最低振动能级的激发分子，则可能发生TT11→S→S00的辐射跃迁而伴随磷光现象，也可能发生的辐射跃迁而伴随磷光现象，也可能发生TT11→S→S00的体系间窜跃。的体系间窜跃。v=0isciscTT11v=0v=02112231VRVRVRVRVRVRisciscv=0S1S2S012PicicFA1A2icic分子内的光物理过程A1、A2.吸收F.荧光P.磷光ic.内转化isc.体系间窜跃VR.振动松弛式中式中KK为常数。因此，在低浓度的情况下为常数。因此，在低浓度的情况下，荧光物质的荧光强度与浓度呈线性关系。，荧光物质的荧光强度与浓度呈线性关系。3.3.荧光强度与浓度的关系荧光强度与浓度的关系对同一物质而言，若对同一物质而言，若abc<<1abc<<1（＜（＜0.050.05或或0.030.03），即对很稀的溶液，荧光），即对很稀的溶液，荧光强度强度FF与该物质的浓度与该物质的浓度cc有以下的关系：有以下的关系：F=2.303ФF=2.303ФffII00aa••bb••cc式中：式中：ФФff－荧光过程的量子效率；－荧光过程的量子效率；II00－入射－入射光强度；光强度；aa－荧光分子的吸收系数；－荧光分子的吸收系数；bb－试液－试液的吸收光程。的吸收光程。II00和和bb不变时：不变时：F=F=KK••CC图图AA为一极稀的溶液，在入射光为一极稀的溶液，在入射光II00照射下照射下所发生的荧光均匀地分布在液池中；所发生的荧光均匀地分布在液池中；图图BB为较浓的为较浓的溶液，入射光被液池前部的荧光体剧烈吸收后而溶液，入射光被液池前部的荧光体剧烈吸收后而发生较强的荧光，但在液池中、后部分的荧光体发生较强的荧光，但在液池中、后部分的荧光体，则因入射光强度大大减弱而使所产生的荧光强，则因入射光强度大大减弱而使所产生的荧光强度大大下降。因而在检测器窗口所探测到的荧光度大大下降。因而在检测器窗口所探测到的荧光强度反而更低。强度反而更低。4.4.偏离线性关系的原因偏离线性关系的原因⑴⑴内滤效应内滤效应I0ItF图AItI0F图B内滤效应示意图内滤效应示意图返回在浓度较高的溶液中，可能发生在浓度较高的溶液中，可能发生溶质与溶质间的相互作用，产生荧光物质的溶质与溶质间的相互作用，产生荧光物质的激发态分子与其基态分子的复合物或荧光物激发态分子与其基态分子的复合物或荧光物质的激发态分子与其它溶质基态分子的质的激发态分子与其它溶质基态分子的复合复合物物，从而导致荧光强度的下降。在浓度更大，从而导致荧光强度的下降。在浓度更大时，甚至可能产生荧光物质基态分子的时，甚至可能产生荧光物质基态分子的聚集聚集体体，导致荧光强度更严重的下降。，导致荧光强...
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