表面展示南极假丝酵母脂肪酶B的重组毕赤酵母高密度发酵条件优化冯琮;林影;梁书利;苏国栋;韩双艳【摘要】以Invitrogen公司提供的毕赤酵母发酵工艺手册为依据,先用摇瓶模拟甘油分批发酵,确定了表面展示南极假丝酵母脂肪酶B(CandidaantarctielipaseB,CALB)的毕赤酵母在BSM培养基中生长所需几种重要配方的最佳浓度为:甘油含量40g/L、硫酸铵4g/L、PTM14mL/L和CaSO410mmol/L;然后利用多功能补料摇床确定了菌株最适生长和产酶的pH分别为5.5和7.0,最适生长和产酶温度为30℃;再在2L发酵罐上放大,并对甘油流加模式和甲醇流加模式进行了优化筛选,确定了以9.6mL/(L·h)的流速流加甘油12h能有效提高菌体密度;以6.4mL/(L·h)的流速恒速流加甲醇比恒定溶氧流加甲醇诱导产酶更佳.最终单位菌体酶活力可达348.4U/g,比甘油含量40g/L、硫酸铵10g/L、PTM14.35mL/L、CaSO40.93g/L,以6.4mL/(L·h)的流速流加甘油4h和以恒定溶氧流加甲酵的未优化条件下提高34.8%.最后通过细胞表面荧光强度检测和全细胞催化合成活力对比,发现优化后单位菌体展示的蛋白表达量得到提高.【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2010(036)009【总页数】6页(P29-34)【关键词】发酵优化;酵母表面展示;南极假丝酵母脂肪酶B;高密度【作者】冯琮;林影;梁书利;苏国栋;韩双艳【作者单位】华南理工大学生物科学与工程学院广东省发酵与酶工程重点实验室,广东,广州,510006;华南理工大学生物科学与工程学院广东省发酵与酶工程重点实验室,广东,广州,510006;华南理工大学生物科学与工程学院广东省发酵与酶工程重点实验室,广东,广州,510006;华南理工大学生物科学与工程学院广东省发酵与酶工程重点实验室,广东,广州,510006;华南理工大学生物科学与工程学院广东省发酵与酶工程重点实验室,广东,广州,510006【正文语种】中文脂肪酶[EC.3.1.1.3]可催化酯类化合物的分解、合成、酯交换等多种反应,具有高度的化学、区域和立体选择性,在有机合成、制药、去污剂、生物表面活性剂合成等领域得到广泛应用。在众多脂肪酶中,南极假丝酵母脂肪酶B(CandidaantarcticlipaseB,CALB)的用途最为广泛,它对非水溶性和水溶性底物都有很强的催化活性[1]。以表面展示有CALB的毕赤酵母(Pichiapastoris)全细胞作为催化剂,它在具有固定化酶的优点的同时,还具有生产工艺简单,标准的发酵过程以及简单的冻干即可实现酶制剂的制备等特点。国外和本实验室均已发表了将南极假丝酵母脂肪酶B展示于酿酒酵母、毕赤酵母表面的相关报道[2-3]。毕赤酵母可实现高密度发酵,单位体积发酵液内可生产更多的外源蛋白。目前,应用最为广泛的是由Invitrogen公司提供的毕赤酵母发酵工艺手册,提供的发酵条件对于毕赤酵母高密度表达外源蛋白具有普适性,但针对展示于酵母表面的酶,尚需进一步优化[4-7]。国内外尚未有针对表面展示南极假丝酵母脂肪酶B的重组毕赤酵母高密度发酵条件优化的相关报道。本研究以Invitrogen公司提供的毕赤酵母发酵工艺手册为依据,先利用摇瓶模拟甘油分批培养阶段进行培养基等条件的优化,再利用2L通气搅拌罐对甘油流加模式和甲醇流加模式进行了优化。毕赤酵母重组菌株GS115/KNS-CALB,为本实验室构建及保藏[2],带有Flag标签。YPD固体培养基:1%酵母提取物,2%蛋白胨,2%葡萄糖,2%琼脂。YPD液体培养基:1%酵母提取物,2%蛋白胨,2%葡萄糖。BSM培养基:(NH4)2SO410g/L,CaSO40.93g/L,K2SO418.2g/L,MgSO414.9g/L,甘油40g/L,PTM1溶液4.35mL/L。PTM1低盐溶液:CuSO46.0g/L,KI0.8g/L,MnSO43.0g/L,Na2MoO40.2g/L,H3BO30.2g/L,CoCl20.5g/L,ZnCl220.0g/L,FeSO4·7H2O65.0g/L,生物素0.2g/L,H2SO45.0mL/L。补料生长培养基:50%甘油(W/V)(含12mL/LPTM1)。甲醇诱导培养基:100%甲醇(含12mL/LPTM1)。磷酸盐缓冲液(1×PBS):NaCl1.37mol/L,KCl0.027mol/L,Na2HPO40.1mol/L,KH2PO40.02mol/L,pH7.4,配成1L,然后取出100mL与900mL无菌水混合均匀。1×TBS:0.1%Tween-20,1%BSA,100mL1×PBS。牛血清白蛋白(BSA):Geneview公司,北京鼎国分装。鼠源Anti-FlagM2抗体:美国Stratagenes公司。AlexaFluor488标记羊抗鼠IgG抗体:MolecularProbes公司。正己酸、正庚烷、无水乙醇:PCA公司,分析纯。对硝基苯酚丁酸酯(pNPB):...
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