Pichia酵母表达直接PCR1.平板上的菌落长到肉眼可见时〔约12小时〕；2.取1ml酵母悬液4000rmp离心，pbs重悬，煮沸5mins，放到冰上5mins，直接就可以用做pcr的模板了3.将除了模板之外的其它PCR反响液的组分准备好，并分装。3.用灭菌的牙签挑取菌落，在PCR管中涮一下，PCR扩增，利用5’AOX1和3’AOX1引物对转化子进行PCR复筛,同时检测基因插入(如果重组质粒以单交换的方式整合到Pichiapastoris基因组，那么会扩增到两条带，一条为2.2kb〔KM71为3.6kb〕宿主茵AOXI基因，另一条为包括目的基因和成熟肽序列和a-factor)Each50µlaliquotofcompetentPichiacellswith3µglinearizedplasmidDNAwillyield50coloniesonselectivemedium.Muts表型重组酵母的诱导表达实验Asageneralrulewheninducingexpression,neverallowculturestobemorethan10-30%ofyourtotalflaskvolume.1.挑选一单菌落，置于装有50mlMGY、BMG或BMGY培养基的500ml摇瓶中，于28-30°C/250-300rpm培养至OD600=2-6(~16-18h)；2.室温下1500~3000g离心5min，收集菌体，用1/5到1/10原培养体积的MM,BMM或BMMY重悬菌体〔约2.5~5ml〕；3.将步骤2所得的菌液置于100ml的摇瓶中，用双层纱布或粗棉布封口，放置于28-30°C/250-300rpm的摇床上继续生长；4.每24h向培养基中添加100％甲醇至终浓度为0.5～1.0%；5.按时间点分别取菌液样品，取样量为1ml，置于1.5mlEP管中，最大转速离心2~3min，分别收集上清和菌体，分析目的蛋白的表达量和菌液最正确收获时间。时间点一般取：0、24、48、72、96和120h；6.对分泌表达，别离样品的上清液；对胞内表达，别离样品的菌体沉淀，带检测样品用液氮或干冰速冻后，于-80°C保存备用；7.可以用SDS-PAGE、Western-Blot及活性实验检测与鉴定重组蛋白的表达。Mut+表型重组酵母的诱导表达实验1.挑选一单菌落，置于装有25mlMGY、BMG或BMGY培养基的250ml摇瓶中，于28-30°C/250-300rpm培养至OD600=2-6(~16-18h)；2.室温下1500~3000g离心5min，收集菌体，用MM、BMM或BMMY重悬菌体，使OD600=1.0左右〔约100~200ml〕；3.将步骤2所得的菌液置于1L的摇瓶中，用双层纱布或粗棉布封口，放置于28-30°C/250-300rpm的摇床上继续生长；4.每24h向培养基中添加100％甲醇至终浓度为0.5～1.0%；5.按时间点分别取菌液样品，取样量为1ml，置于1.5mlEP管中，最大转速离心2~3min，分别收集上清和菌体，分析目的蛋白的表达量和菌液最正确收获时间。时间点一般取：0、6、12、24、36、48、60、72、84和96h；6.对分泌表达，别离样品的上清液；对胞内表达，别离样品的菌体沉淀，带检测样品用液氮或干冰速冻后，于-80°C保存备用；7.可以用SDS-PAGE、Western-Blot及活性实验检测与鉴定重组蛋白的表达。BMGY和BMMY的换液方式有2种：1）一种是离心换液，即在生长培养结束后，转移到灭菌大离心管中，4000rpm室温离心5分钟后，用BMMY洗下菌体，再转移到摇瓶，整个过程均用灭菌移液管操作。2）另一种是静止换液，即在生长培养结束后，将摇瓶是离心换液或者静止换液，到底那个好，只有根据自己的实验结果来考量。如果只是从防治污染的角度来说，静止换液也好一些，因为操作毕竟少一些，速度也快。用新开启的分析纯甲醇，一直放在无菌室里面，每次直接用灭菌TIP吸取参加摇瓶就可以了。也有人试过用膜过滤，结果膜都溶解了。菌体是在BMMY中培养的，可以不用BMMY做对照，在600nm处测OD值，培养基和PBS光吸收都很低，PBS更方便。如果用1体积的BMGY，在生长阶段结束后，换液时，参加1/10-瓶很难摇瓶不能像发酵罐那样保证通气量，但可以通过装量来暂时替代这个指标。Mut+/Muts的筛选用SacI，SalIorStuI线性化插入HIS4位点的载体转化GS155后，多数转化子应为Mut+，但也有His+Muts的转化子存在〔见Invitrogenprotocolp36〕，NotIorBglII线性化插入AOXI位点的载体转化GS155后，用MD/MM平板可区分Mut+/Muts。UsetheplatescontainingtheHis+transformantsandscreenfortheMut+andMutSphenotypeasdescribedbelow.1.Usingasteriletoothpick,pickonecolonyandstreakorpatchoneHis+transformantinaregularpatternonbothanMMplateandanMDplate,makingsuretopatchtheM...
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