实验八T淋巴细胞转化试验T淋巴细胞增殖分化、DNA等大分子物质合成增加淋巴母细胞刺激物PHA体积变大胞浆增多、空泡核仁明显核染色质疏松基本原理有丝分裂同位素法MTT法形态法检测方法：形态学计数法MTT法同位素法实验目的实验原理试剂与器材操作步骤结果判断注意事项实验讨论教学内容：一、形态学计数法实验目的1.掌握T淋巴细胞转化试验的原理。2.熟悉淋巴母细胞的形态特征及判定方法。T淋巴细胞在有丝分裂原PHA等刺激后，细胞的形态和代谢发生变化，发生一系列增殖反应，如出现细胞体积增大、核染色质疏松、蛋白质和核酸合成增加，并转化为淋巴母细胞。实验原理1.RPMIl640培养液。包含：小牛血清10%、青霉素100u/m1、链霉素100ug/m1，用无菌的3%NaHCO3调pH至7.2～7.4。2.植物血凝素（PHA）。用含10%小牛血清的RPMI培养液稀释至500～1000g/ml。试剂与器材3.姬姆萨染液。4.标本肝素抗凝人外周静脉血。5．器材细胞培养瓶、CO2培养箱、超净台、高压灭菌器、无菌过滤装置、离心机、显微镜等。试剂与器材5%CO237℃72h1500rpm离心10min染色镜检观察细胞形态PHA无PHA外周血0.2ml吸取白细胞层涂片操作步骤1．取肝素抗凝血0.2ml，注入预先加有1.8mlRPMI1640培养液的培养瓶内，同时加入PHA(500g/ml)0.1ml，对照瓶内不加PHA。混匀后置37C、5%CO2培养箱内孵育72h，期间每天旋转摇匀一次。2．培养结束后，弃去上清，混匀细胞，加入离心管中，1500rpm离心10min。操作步骤3．弃上清，吸取白细胞层制片，自然干燥。4．甲醇固定1～2min后，姬姆萨染色15～20min，水洗，干燥。5．油镜下计数200个淋巴细胞，观察淋巴细胞的形态变化，计算淋巴细胞转化率。操作步骤淋巴细胞标志及功能检测龚道科2002.4未转化的淋巴细胞淋巴母细胞结果判断未转化和转化淋巴细胞的形态特征转化的淋巴细胞未转化的淋巴细胞淋巴母细胞过渡型细胞大小(直径μm)12～2012～166～8核大小、染色质增大、疏松增大、疏松不增大、密集核仁清晰、1～4个有或无无有丝分裂有或无无无胞质、着色增多、嗜碱增多、嗜碱极少、天青色浆内空泡有或无有或无无伪足有或无有或无无四、结果观察可以见到以下几种类型细胞(1)成熟的小淋巴细胞：与未经培养的小淋巴细胞一样为6-8um，核染色致密，无核仁，核与胞浆比例大，胞浆染色为轻度嗜碱性。淋巴细胞标志及功能检测龚道科2002.4(2)淋巴母细胞：细胞体积增大，约20-30um，形态不整齐，常有小突出，核质染色疏松，有核仁l-2个，胞浆变宽，常出现胞浆空泡。淋巴细胞标志及功能检测龚道科2002.4(3)过渡型淋巴细胞：比小淋巴细胞大，约l0-20um，核染色致密，但出现核仁，此为与成熟小淋巴细胞鉴别要点。结果判断(4)其它细胞：如中性粒细胞在培养72h后，绝大部分衰变或死亡，呈碎片。2．淋巴细胞转化率的计算：按上述分类检查推片头、体、尾三部分，分别计数淋巴母细胞、过渡型母细胞和核有丝分裂相细胞以及成熟的小淋巴细胞，以前三者为转化细胞，每份标本计数200个细胞，按下列公式计算转化率：%100胞数转化和未转化的淋巴细转化的淋巴细胞数转化率在正常情况下，PHA诱导的淋巴细胞转化率为60％一80％，如为50％一60％则偏低，50％以下则为降低。1．培养基成分对转化率影响较大，注意其有效期。2．小牛血清用前需灭活。3．培养时要保证有足够的气体，保证无菌。4．PHA剂量过大对细胞有毒性，PHA转化反应剂量一般10m1，培养瓶内液体总量不要超过2m1，太小不足以刺激淋巴细胞转化，试验前应先测定。注意事项二、MTT比色法实验目的熟悉MTT比色法进行淋巴细胞转化试验的原理及其操作方法。一、原理T淋巴细胞受到PHA作用后发生活化增殖，其胞内线粒体琥珀酸脱氢酶活性相应升高，四甲基噻唑蓝（MTT）作为其底物参与反应，被催化形成蓝紫色结晶甲臢(fomazan)，经盐酸─异丙醇或溶解后为蓝色溶液。甲的形成量与细胞增殖臢活化的程度呈正相关。实验原理1.RPMIl640培养液。2.植物血凝素（PHA）。3.标本肝素抗凝人外周静脉血。4.器材超净台、96孔细胞培养板、CO2培养箱、高压灭菌器、无菌过滤装置、振荡器、酶...
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