高酶活烟酰胺生产菌株的筛选及腈水合酶催化反应条件优化摘要烟酰胺作为B族维生素的重要成员，参与了机体内两种重要辅酶的形成。烟酰胺作为重要的营养性添加剂被广泛应用于应用于饲料生产行业，其在医药、食品、化妆品行业的应用前景也非常广阔。在工业生产方面，人们主要利用化学法和微生物法进行烟酰胺生产。烟酰胺的微生物生产法有着化学法无法比拟的优越性，此方法对环境几乎不造成污染，且生产成本低，工艺简便。在本实验中，主要以下四个方面进行了实验研究并取得了一定的成果：(1)以实验室现有菌种HD1220为出发菌株，分别使用ARTP诱变、微波诱变、EMS诱变三种单因子诱变以及在各因子最佳诱变条件下的复合诱变，确定了复合诱变的最佳条件为：ARTP诱变时间240s；微波诱变强度60%，微波照射时间90s，；EMS浓度0.8%。诱变完成后，筛选出一株能够稳定遗传且酶活高达1764U的高腈水合酶活性菌株，与出发菌株相比，诱变后菌株酶活提高了33.13%，并将该菌株暂时命名为NHD-1。(2)利用HPLC对烟酰胺进行检测，通过对HPLC检测的紫外检测波长、流动相流量、流动相比例三个条件进行的单因素优化实验，最终确定HPLC检测烟酰胺的各个最优条件为：紫外检测波长为220nm，流动相的流量为0.4mL/min，流动相中甲醇：水=1：3。在以上条件下，烟酰胺出峰时间为5.306min，与条件优化前相比，烟酰胺出峰时间明显缩短。(3)对腈水合酶参与烟酰胺生产过程中酶催化反应条件进行单因素优化实验，我们得出各因素的最佳条件为：菌体浓度1.8%，菌龄48h，底物浓度100g/L，温度29.5℃，PH7.4，反应时间30min，在实际发酵后期应该对产物烟酰胺进行及时分离。通过Plackett-Burman实验设计我们分析出底物浓度、温度和PH这三个因素对腈水合酶的酶活有及其显著的影响；通过对这三个因素进行响应面优化设计，我们得出了这三个因素的最佳条件组合为底物浓度98.88g/L，反应温度29.59℃，PH值7.46。在此条件下酶活响应值为1784U。对SAS软件统计分析结果进行三次验证实验，得到腈水合酶的实际酶活为1775U，与多元回归分析所得理论值吻合，说明利用响应面法能够很好的优化酶催化反应条件。ABSTRACTNicotinamideisakindofVitaminBandit’sveryimportant.Inthebody,It’sonepartoftheformationoftwokindsofcoenzyme.Nicotinamideismainlyusedinfeedindustryasnutritionadditives,italsohasaverybroadapplicationprospectinmedicalindustry,foodindustryandcosmeticsindustry.Intheindustrialproductionofnicotinamide,wemainlyusechemicalmethodandbiologicalmethod.Thebiologicalmethodhasabigsuperioritythatchemicalmethodhasn’titdoeslittleharmtotheenvironmentandhasalowerproductioncost,andit’sverysimpleinprocess.Undertheconditionsoflaboratory,wemainlycarriedoutourresearchinseveralaspectsandachievedsomeresultsasfollows:(1)StartedfromthestrainNorcardiasp.HD9611wehadinthelaboratory,weusedthemethodofARTPmutagenesis,microwavemutagenesisandEMSmutagenesistomakemutagenesisofthestrain.Thethreemethodswereallusedalone.Thenwemadethecompositemutagenesisunderbestconditionsofthethreemethodofmutagenesis.Thebestconditionsofcompositemutagenesiswere:thetimeofARTPmutagenesiswas240s;thetimeandintensityofmicrowavewere90sand60%;theconcentrationofEMSmutagenesiswas0.8%.Bythemutagenesiswescreenedonestainwhosenitrilehydratasehadaveryhighenzymeactivityof1764Uandthestainhadstableheredity.ComparedtothestainNorcardiasp.HD9611,theenzymeactivityincreasedby33.13%,andwenamedthestainasNHD-1.(2)InthedetectionofNicotinamide,weusedtheHPLCmethod.ByoptimizingthewavelengthofUVdetection,theflowrateofmobilephaseandtheproportionofmobilephaseintheHPLCassay,wegotthebestconditionsofHPLCmethod:thewavelengthofUVdetectionwas220nm;theflowrateofmobilephasewasmethanol:water=1:3;theproportionofmobilephasewas0.4mL/min.undertheseconditions,thepeaktimeofniacinamide...
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