生产用种细胞鉴定的相关检测技术摸索与掌握1、前言在历史上，由于细胞源性的生物制品存在外来的污染物或出于对用于制备产品的细胞性质方面的考虑，引发了一些对产品质量的关切。重组DNA(rDNA)制品的质量也与细胞基质中构建的表达载体有关：由此，人们达成共识，认为细胞基质的特性以及与之相联系的事件将影响产品的质量和安全性，为有效地控制产品质量，需对操作细胞基质的各方面进行严格控制。用连续传代培养的细胞生产生物技术产品及生物制品的最大优点是使每批产品都有一个经检定过的共同起源，即细胞的储备库。要避免被污染的细胞基质(或细胞库)用于生产，摸索与掌握生产用种细胞鉴定的相关检测技术并对被污染细胞进行排除是十分重要的，否则，由于受污染的细胞库不能使用，必须重新建立细胞库，这将延误产品上市或开发的时机。2、目前的生产用种细胞库及其检测技术现状分析生产部门各车间虽储备了一些细胞资源，有细胞库的存在，但不完善，比如一些细胞只有粗略简单的记录（冻存人和日期），对于其传代的稳定性、产毒效果、及其相应支原体检测、外源病毒和细胞的检测等都未涉及。而在实际生产中，由于生产用细胞存在外来污染物给生产带来了不小的影响，使生产质量不够稳定，抗原毒价难以提高，而表现最为明显的是支原体的污染。支原体污染细胞后，存在于细胞间隙或依附于细胞膜上生长，对培养细胞产生各种各样的恶果：多数细胞感染后，细胞形态并无明显变化，特别是一些肿瘤细胞系株，虽然有支原体污染，细胞仍然生长迅速，培养上清液仍然清亮。一般情况不会引起明显的细胞病变，所以不易察觉，但随时间延长，由于竞争营养成分及支原体代谢产物的毒性作用，细胞生长活性受到影响，可显著影响生产用细胞的培养及相应生物活性的发挥，并影响病毒培养的产量。改变各种代谢活动致使不能进行培养细胞的正常生化研究；有的细胞污染后可有明显的改变，如生长速度减慢甚至停止、细胞体积增大，细胞碎片越来越多，培养瓶中细胞与细胞间隙出现膜状沉积，细胞无法传代、部分细胞变圆并从培养瓶壁上脱落等，很大程度上影响生产以及苗毒质量的提高。例如08年的蓝耳生产，由于组织了相关提高蓝耳毒价系列实验，对其工艺关键控制点进行了进一步的准确把握，使生产的前期毒价得到明显提高，但后期毒价又回落下来。同样在开展利用抗体血清提高蓝耳毒价实验时，使用了含抗体血清的比不含的毒价明显高一个滴度，但其最终收获的毒价却远低于接种时的种毒毒价，达不到理想效果。而这两种情况有一个共同点：细胞状态不好，病毒繁殖不理想。后取细胞样送检，均支原体阳性，足见其对生产造成的影响是不容忽视的。而我中间监测组虽向质检和产品技术部取得支持，通过摸索掌握了支原体检测的基本方法，可利用产品技术部提供的液体培养基进行检测。但光从支原体液体培养基的颜色变化来判定阳性不够严谨，因为假阳性的可能性较大。按照规程上的标准检测方法是要通过固体培养基培养获得典型菌落并鉴别才能确切判定，而质检和产品技术部目前在这一检测方面，液体培养基的检测技术比较成熟，其缺陷在于存在的假阳性或假阴性的可能性较大，根据国际通行的标准，必须根据标准程序中的固体培养基中培养出支原体菌落才能最终定论，而我公司在固体培养基的支原体检测技术方面不太成熟。细胞系鉴定和检测的一般原则：对建系细胞基质的鉴定和检测是生物技术产品及生物制品质量控制的重要组成部分。通过对主细胞库的鉴定，可对是否存在来自其他细胞系的细胞、外来和内在因子以及其他污染物(如来自于宿主的毒素或抗生素)进行评估。检测的目的是为了证实用于生产的细胞基质的特性、纯度和可用性。在有些情况下，其他方面如致癌性或胞核学的检测也是有用的。对某一细胞基质选择何种检测方案要根据细胞的生物学特性(如生长的需求)、它的培养历史(如人源和动物源性的生物试剂的使用)和可应用的试验方法而定。细胞基质的鉴定程度将影响以后的生产阶段所需的常规试验的类型或水平。生产厂家应对每个主细胞库作一次纯度试验和鉴别实验，对将要注册的每一产品在细胞培养期间作一次稳定性试验。此外，还要对每一个工作细胞库作纯...
