大肠杆菌耐药株的体外诱导及其acrA和marA基因分析张海旺1邓旭明2*张煜1苏杰1胡仲明3（1.河北北方学院，河北张家口，075131；2.中国人民解放军军需大学，吉林长春；130062；3.军事兽医研究所，吉林长春；130062）摘要：目的检测大肠杆菌在某些抗菌素的环境压力下耐药性的变化及其与acrA和marA基因突变的关系。方法分别用四环素、氯霉素和环丙沙星对大肠杆菌质控株ATCC25922进行体外诱导培养，测定诱导前后多种抗菌药的MIC的变化；对各菌株的acrA和marA基因进行克隆和测序。结果四环素诱导株产生多重耐药，氯霉素和环丙沙星的诱导引起单药耐药；四环素诱导株、氯霉素诱导株和环丙沙星诱导株的acrA和marA基因序列均与ATCC25922的一致。结论四环素、氯霉素和环丙沙星的诱导培养并未引起ATCC25922的acrA和marA基因的突变，诱导引起的大肠杆菌耐药性变化是由于其acrA和marA基因突变以外的其他原因所致。关键词：大肠杆菌多重耐药外输泵acrAmarA由于抗菌药物的广泛、持续和不当使用，各种病原菌对抗菌药物的耐药性日趋严重。现已发现细菌细胞膜上的外输泵（effluxpump）的表达水平提高，能主动将扩散入细菌细胞内的药物或其他底物泵出菌体外，从而使细菌获得非特异性的耐药性。大肠杆菌是畜禽的重要致病菌，是发现外输泵最多的细菌，现已发现了约30种外输泵。一般认为AcrAB－TolC是大肠杆菌主要的外输泵[1]。它包括药物质子转运子AcrB、周质融合蛋白AcrA和外膜通道蛋白TolC[2]。MarA是一个正调控蛋白，可增强acrAB和tolC的表达。本实验用四环素、氯霉素和环丙沙星通过人工体外诱导大肠杆菌使之产生耐药性，对AcrA和MarA的基因acrA和marA进行测序分析，检测耐药性产生与acrA和marA突变的关系。1材料和方法1.1材料菌株：大肠杆菌质控株ATCC25922，购自吉林省卫生监督检测中心。抗菌药：头孢噻肟、青霉素钾等，均为标准品或对照品，中国药品生物制品检定所出品；盐酸环丙沙星，对照品，中国兽医药品监察所出品。染色试剂：结晶紫酒精饱和溶液、草酸铵溶液、革兰氏碘溶液、石碳酸复红溶液等按《药品微生物学检验手册》[3]进行配制。载体与质粒：克隆载体为pGEM－T，Promega公司产品。酶与试剂：T4DNA连接酶、ExTaqTMDNA聚合酶、各种限制性内切酶、溶菌酶、蛋白酶K均为TaKaRa公司产品。其他试剂：乙二胺四乙酸二钠（EDTANa2）、焦碳酸二乙酯（DEPC），Sigma公司产品；dNTP、5－溴－4－氯－3－吲哚半乳糖苷（X－gal）、异丙基－β－D－硫代半乳糖苷（IPTG）、氨苄青霉素（Amp）、琼脂糖、羟基甲基氨基甲烷（Tris）等均为TaKaRa公司产品；饱和酚、氯仿、异丙醇、CaCl2、葡萄糖、甲基红等，均为国产分析纯试剂；DNA片段凝胶回收试剂盒（AgaroseGelDNAPurificationKitVer.2.0），TaKaRa公司产品；国家自然基金资助项目，No30270999作者介绍：张海旺，生于1956年，博士，教授。研究方向：耐药机理。*通讯作者E-mail：zhw5148@yahoo.com..cn分子量标准参照物：DNAMarkerDL2,000、λ－HindⅢdigestDNAMarker，均为TaKaRa公司产品。引物：根据GenBank中acrA、marA基因序列设计PCR扩增引物：acrA的上游引物（PACR－F）序列为5´－ATGAACAAAAACAGAGGGTTTACGCCT－3´；下游引物（PACR－R）5´－TTAAGACTTGGACTGTTCAGGCTG－3´，marA的上游引物（PMAR－F）序列为5´－ATGACGATGTCCAGACGCAATAC－3´，下游引物（PMAR－R）5´－CTAGCTGTTGTAATGATTTAATGG－3´。上海博亚生物技术有限公司合成。仪器：生物显微镜，OLYMPUS产品；PCR扩增仪，TC－25/H型，杭州DAHETHERMO－MAGNETICSCO.LTD产品；电泳仪，DYY－6B型，北京市六一仪器厂产品；空气浴振荡器，HZQ－C，哈尔滨市东明医疗仪器厂生产；高速台式冷冻离心机，TGL－16M，长沙湘仪离心机仪器有限公司生产等。1.2.方法1.2.1菌株鉴定对购进的菌株作生化和形态鉴定，以确保菌株的可靠性：用营养肉汤作复苏培养，再将菌液接种于琼脂平板37oC培养至长出菌落；取上一步得到的单菌落进行糖发酵试验（葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖）、靛基质试验、M.R试验、V—P试验鉴定及革兰氏染色的光镜观察。鉴定确认为ATCC25922的菌株作后续实验之用。1.2.2MIC测定按照NCCL...
