应用生物质谱分析蛋白质磷酸化位点项目完成人员：王红霞李卫华李爱玲刘炳玉项目完成单位：军事医学科学院国家生物医学分析中心摘要蛋白质的可逆磷酸化具有重要的生物学意义，对蛋白质磷酸化位点进行分析有助于阐明蛋白质磷酸化的机制与功能。生物质谱是目前进行蛋白质磷酸化分析最有力的方法之一。我们用天然磷酸化蛋白建立了中性丢失扫描和固相金属亲和色谱（IMAC）两种基于质谱的磷酸化蛋白分析方法。应用这两种方法均可将从蛋白质酶切混合物中找出磷酸化肽段，进而通过序列分析定位磷酸化位点。两种方法具有不同的特点及局限性，具体研究中还要视具体情况优化实验条件。蛋白质可逆磷酸化是最普遍、最重要的一种蛋白质翻译后修饰（PTM）。在哺乳动物中大约有三分之一的蛋白质被认为是磷酸化修饰的，对众多生物化学功能起开/关调控作用，是一种普遍的调控机制。细胞内蛋白质的磷酸化在信号传导中发挥着非常重要的作用。蛋白质组研究的一个重要方面就是蛋白质磷酸化修饰的分析鉴定。目前没有一个自动测序方法能够对三种主要的磷酸化氨基酸，即磷酸化丝氨基酸（pSer）、磷酸化苏氨基酸（pThr）和磷酸化酪氨酸（pTyr）。毛细管电泳（CE）可以分析蛋白质或多肽的磷酸化及磷酸化氨基酸，但是鉴定蛋白质磷酸化位点首先要用高效液相色谱（HPLC）分离蛋白的酶解肽段，然后用CE筛测磷酸化肽，最后用自动Edman降解氨基酸分析法确定其磷酸化位点，工作量大，不是快速和高通量分析方法。生物质谱（MS）是揭示蛋白质许多翻译后修饰和蛋白质一级结构分析的一个不可缺少的工具，所用的蛋白质样品量在fmol水平。是唯一能够与蛋白质组研究水平相匹配的方法。近年来，生物质谱的发展显著地促进了对具有生物学功能的磷酸化蛋白质的研究，是国际上当前最重要的一个前沿领域，也是目前蛋白质组研究的一个重要方面。这种方法的成功建立，将使人们对磷酸化蛋白质的研究跨上一个新的台阶，对功能性蛋白的寻找和作用机制探寻具有重要意义，在国内具有广泛的需求。但由于一起条件等限制，国内此方面的报道还不多。我们用天然磷酸化蛋白建立了中性丢失扫描和固相金属亲和色谱（IMAC）两种基于质谱的磷酸化蛋白分析方法。中性丢失扫描法具有很高的灵敏度，检测限在fmol级。固相金属亲和色谱（IMAC）法是近年来应用最广泛的特异性富集磷酸化肽段的方法，该方法适用于微量复杂样品的处理。目前微量IMAC预装柱ZipTipMC已经商品化，可以方便的与Nanospray微量分析系统相匹配。这两种方法的建立和成熟运用将为磷酸化蛋白的研究提供便利条件。一、材料与方法1．材料试剂：ZipTipMC，ZipTipμ-C18为millipore公司产品。磷酸化蛋白β-casein蛋白为sigma产品，纯度90％。Trypsin为德国Roche诊断公司经修饰的测序级的酶（产品编号1418025），硝酸鉫（Ga(NO3)3）为Aldrich公司产品；实验用水为Milli-Q纯水器制备的超纯水。色谱纯乙腈为美国FisherScientific产品；a-氰基-4-羟基肉桂酸(a-CCA)为Bruker提供；三氟乙酸(TFA)为Fluka公司产品。其它试剂均为国产分析纯。仪器：电喷雾四极杆飞行时间串联质谱仪（Q-Tof2，Micromass），配有masslynx数据系统。基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱仪(Autoflex，Bruker)。2．方法1)蛋白的溶液酶切：称取标准磷酸化蛋白β-casein50μg，溶于50μL25mMNH4HCO3中。加入分装保存的胰蛋白酶1ug，37℃，12h后取出部分稀释成所需浓度备用。2)离子亲和层析IMAC法富集磷酸化肽段：ZipTip①MC用0.1％乙酸／50％乙腈／水溶液洗3次，②用200mMGa(NO3)3溶液洗10次，③用超纯水洗3次，④用1％乙酸／10％乙腈／水溶液洗3次，⑤0.1％乙酸／10％乙腈／水溶液洗5次，⑥蛋白质酶解混合物用酸性溶液（20％乙酸或1％甲酸水溶液）调pH至2以下，用ZipTipMC吸取、排出10次以上，⑦ZipTipMC用0.1％乙酸／10％乙腈／水溶液洗6次，⑧用超纯水洗3次，⑨2－3μL0.3N氨水洗脱；3)质谱分析：电喷雾质谱仪为英国Micromass公司的电喷雾四极杆正交加速飞行时间串联质谱仪Q-TOF2。配备毛细管液相色谱和纳升喷雾源。镀金属钯的硼硅酸盐电喷雾针（palladiμm-coatedborosilicateelectrosprayneedle）(Protana,Odense,Denma...
