在分子克隆实验中,有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性核酸内切酶切开,因此在设计 PCR 引物时，人为的在酶切位点序列的 5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。添加保护碱基,需要考虑两个因素:一是碱基数目,一是碱基种类。添加保护碱基时,最关怀的应该是保护碱基的数目,而不是种类。什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的，见附表。添加什么保护碱基,假如严格点,是根据两条引物的 Tm 值和各引物的碱基分布及 GC 含量.假如某条引物 Tm 值偏小,GC％较低，添加时多加 G 或 C，反之亦反。保护碱基列表EnzymeOligo SequenceChainLength％ Cleavage2 hr20 hrAccIGGTCGACC CGGTCGACCG CCGGTCGACCGG 8 10 12 0 0 0 0 0 0 AflIIICACATGTG CCACATGTGG CCCACATGTGGG 8 10 12 0 >90 〉90 0 〉90 >90 AscIGGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA 8 10 12 >90 >90 >90 >90 >90 〉90 AvaICCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA 8 10 12 50 〉90 〉90 >90 〉90 >90 BamHICGGATCCG CGGGATCCCG CGCGGATCCGCG 8 10 12 10 〉90 〉90 25 >90 〉90 BglIICAGATCTG GAAGATCTTC GGAAGATCTTCC 8 10 12 0 75 25 0 〉90 〉90 BssHIIGGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA 8 10 12 0 0 50 0 0 >90 BstEIIGGGT（A/T)ACCC 9 0 10 BstXIAACTGCAGAACCAATGCATTGG AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT 22 24 27 0 25 25 0 50 〉90 ClaICATCGATG 8 0 0 GATCGATC CCATCGATGG CCCATCGATGGG 8 10 12 0 〉90 50 0 〉90 50 EcoRIGGAATTCC CGGAATTCCG CCGGAATTCCGG 8 10 12 〉90 〉90 〉90 >90 〉90 〉90 HaeIIIGGGGCCCC AGCGGCCGCT TTGCGGCCGCAA 8 10 12 >90 >90 >90 〉90 >90 〉90 HindIIICAAGCTTG CCAAGCTTGG CCCAAGCTTGGG 8 10 12 0 0 10 0 0 75 KpnIGGGTACCC GGGGTACCCC CGGGGTACCCCG 8 10 12 0 〉90 〉90 0 〉90 〉90 MluIGACGCGTC CGACGCGTCG 8 10 0 25 0 50 NcoICCCATGGG CATGCCATGGCATG 8 14 0 50 0 75 NdeICCATATGG CCCATATGGG CGCCATATGGCG GGGTTTCATATGAAACCC GGAATTCCATATGGAATTCC GGGAATTCCATATGGAATTCCC...
