同源重组的细胞与分子机制主讲人：陈峻松文献分析01结论与展望02补充内容03contentDNA剪切的模型及具体过程；AB各个复合物及其功能；C对5'端特异性剪切的验证DDna2和Sgs1的剪切作用分析EMRX和Top3–Rmi1的促进作用分析FRPA的作用分析同源重组的分子机制ModelforthereconstitutedDNAmotor-drivenendresectionpathway0.Spo11蛋白引发DNA双链断裂，产生无端粒保护的末端；1.MRX利用它对DNA末端高亲和性的特点，与末端相连，启动剪切机制；2.STR复合物驱动DNA双链分离；3.Dna2蛋白与RPA结合，一同切割5'端的单链；4.RPA同时与暴露的3'链结合，防止DNA双链重新结合，也防止3'端被降解。①MRX与断裂处3'单链结合；②STR在MRX的作用聚集在末端；③Sgs1从3'端向5'端运动，解旋DNA；④Dna2从5'端向3'端运动，逐渐剪切5'端单链DNA；⑤RPA在另一侧暴露的3'单链上结合。DNA剪切的模型及具体过程；AB各个复合物及其功能；C对5'端特异性剪切的验证DDna2和Sgs1的剪切作用分析EMRX和Top3–Rmi1的促进作用分析FRPA的作用分析同源重组的分子机制各个复合物及其功能1.MRX：Mre11–Rad50–Xrs2complex；2.STR：Sgs1–Top3–Rmi1complex；Sgs1解旋酶促进DNA链的分离，而Top3–Rmi1复合物和MRX一同起到促进的效果。3.RPA：ThessDNA-bindingproteinreplicationprotein-A；保护3'末端不被降解，加强Dna2对5'的特异性剪切。4.Dna2：具有处理冈崎片段的功能，Dna2核酸酶对剪切是必要的，而Mre11核酸酶并不必要。对不同酶的作用分析①当Dna2,Sgs1或者RPA中的一个被去掉时，DNA链几乎不被剪切；②在缺少Dna2的时候，底物任然能完全解旋产生ssDNA，但在缺少Sgs1时则不行；③DNA解旋一定程度上也依赖于RPA；④缺少MRX或者Top3–Rmi1时DNA的剪切效果被减弱。DNA剪切的模型及具体过程；AB各个复合物及其功能；C对5'端特异性剪切的验证DDna2和Sgs1的剪切作用分析EMRX和Top3–Rmi1的促进作用分析FRPA的作用分析同源重组的分子机制Reconstitutionand5'polarityofDNAendresection.B图：（a)对3'端标记的剪切效果与反应时间的关系；（b）对5'端标记的剪切效果与反应时间的关系；(c)三次平行实验的平均值和标准差；C图：对5'端剪切产物的分析；D图：（a)未断裂和断裂的DNA双链及其一端被生物素标记的分子；（b)这些底物在与A中相同的酶切体系下反应五分钟并分析产物；对5'端的剪切特异性分析通过对比试验可以看出，酶切体系对于5'端的剪切效率远高于3’端：①相同反应时间，5'端剪切更快；②如果在双链一端加上保护结构生物素链霉素亲和物，那么被保护的5'端就不会被剪切，而另一端在反应5min后几乎完全被剪切；③加保护物后最终产物含有5'端被保护的一条DNA单链；其它验证剪切具有特异性的实验内容1超螺旋化的DNA不能被用同样的酶组合剪切，这再次证明了DNA剪切具有末端特异性。对5'端产物的分析分别经过2min和5min后的5'端产物：①产物的大小从四到八个核苷酸。②五核苷酸产物占绝对优势。DNA剪切的模型及具体过程；AB各个复合物及其功能；C对5'端特异性剪切的验证DDna2和Sgs1的剪切作用分析EMRX和Top3–Rmi1的促进作用分析FRPA的作用分析同源重组的分子机制DNA解旋对ATP的依赖性DNA解螺旋需要ATP,而且不能ATP-γ-S或者AMP–PNP代替。Dna2和Sgs1解旋酶对DNA剪切的必要性1.DNA剪切对ATP水解具有依赖性。2.DNA马达Sgs1和Dna2中的任一者或两者的功能可能是必需的。3.利用两种酶的失活突变体dna2-K1080E和sgs1-K706A来判断哪种酶是解螺旋所必需的。4.用sgs1-K706A替换Sgs1导致剪切失效，但dna2-K1080E代替Dna2正常剪切。5.结论：Sgs1解旋酶活性而不是Dna2解旋酶活性对于DSB解螺旋是必需的Dna2蛋白具有剪切3'或5'核酸内切酶的活性，而Mre-11蛋白具有从3'到5'核酸内切酶以及DNA结构特异性内切酶的活性。1用失活的Dna2-D657A蛋白与Mre11-3蛋白和3'端进行反应，我们发现是Dna2核酸酶介导了剪切2即使加入锰离子活化Mre11核酸酶，5'端的剪切依旧完全依靠Dna2。3负责剪切工作的具体蛋白是Dna2核酸内切酶Sae2蛋白与初始剪切相关联，但它的添加不影响剪切的效率或产品尺寸4参与剪切的蛋白质分子特异性1.用Srs2解旋酶（...
