酶的定向进化课程内容•背景介绍•定向进化的定义•定向进化的策略•突变库的构建•突变库的筛选•生物学新技术•定向进化的发展方向•定向进化的应用酶—生物催化的工具OHOOHOOOHNADHNAD•高效性•专一性•多样性•温和性生物催化酶—生物催化的工具•1908年，RosenthalerHOCNOHHCN+(R)-扁桃腈苯甲醛氰化氢植物提取液酶作为生物催化剂的缺点•易变性•活性可调节–平衡反应–产物抑制–底物抑制•有些酶需要辅酶•专一性–立体选择性专一–区域选择性专一–底物范围狭窄OHOOHOOOHNADHNAD乳酸脱氢酶酶分子的改造定向进化的定义•达尔文自然进化论–生物正是通过遗传、变异和自然选择，从低级到高级，从简单到复杂，种类由少到多地进化着、发展着。–自发，缓慢，自然选择定向进化的定义•定向进化–在实验室模仿自然进化的关键步骤，通过突变、重组等基因工程手段和合适的筛选方法，在较短的时间内完成漫长的自然进化过程。–蛋白分子有巨大的进化潜力–可以不需要了解酶的空间结构和催化机制–进化时间短–拓宽了蛋白质工程学的研究和应用范围–获得的酶突变体有巨大的工业应用价值酶的定向进化•1990s，PimStemmer和FrancesArnold•用分子生物学方法在体外模拟达尔文进化快速而有效地改造生物催化剂•定向进化在工具酶的改造中得到广泛应用定向进化的步骤•通过随机突变或基因体外重组创造基因多样性•导入适当载体后构建突变库•通过合适的筛选方法，获得阳性突变体•重复循环，直至获得预期性状的酶定向进化的流程定向进化的策略•无性突变技术–突变来自于单一个体•有性突变技术–突变来自于不同个体无性突变技术•物理或化学诱变剂介导的随机诱变•致突变菌株诱导产生的随机突变•易错PCR•优点：操作简便，随机突变丰富•缺点：正突变概率低，突变库较大，筛选工作量大•难点：控制好突变率易错PCR（error-pronePCR）•提高镁离子浓度•加入锰离子•改变体系中四种的dNTPs浓度•运用低保真度DNA聚合酶连续易错PCR(sequentialerror-pronePCR)•将一次扩增得到的有益突变基因作为下一次扩增的模板，连续反复地进行随机诱变，使每一次扩增得到的正向突变累积而产生重要的有益突变。有性突变技术•DNA改组技术•交错延伸法•随机引物体外重组法•基因家族重排DNA改组（DNAshuffling）•1994年，Stemmer•正突变同源DNA用DNaseI酶切成随机片断，经过不加引物PCR多次循环，获得重新排列的突变DNA的过程。DNA改组（DNAshuffling）•优点：可以实现优势突变的组合，正突变效率高；可以创造新基因，并赋予表达产物新功能•缺点：无引物PCR前必须去除DNase，防止PCR产物被酶切交错延伸PCR（staggeredextensionprocess）•1997年，Arnold•在PCR过程中，将退火和延伸合并成一步，缩短反应时间，使得只能合成出非常短的新生链，经变性的新生链作为下一轮PCR的引物和体系内的不同模板退火而交替延伸。反复进行此过程，直至产生完整的基因长度。随机引物体外重组法（randomprimingrecombination）•1998年，Arnold•使用一套随机引物，先产生大量和模板互补的不同位点的短DNA片段。去除模板后，这些短DNA片段互为引物和模板进行PCR，直至组装成完整的基因长度。基因家族改组技术•1998年，Crameri•优点：基因家族成员之间存在显著差异，所得突变库基因多样性高，增加了正向突变的概率定向进化和理性设计•通常意义上，定向进化使用随机突变和重组策略•蛋白质的晶体结构和酶的催化机理研究为合理选择突变位点提供便利•定向进化–不需要知道酶的空间结构、活性位点、催化机理等–正向突变概率低，突变库相对庞大，筛选工作量大，筛选成本高•理性设计–事先找出酶的关键氨基酸位点，有目的地改造–正向突变概率高半理性设计半理性设计的突变策略•饱和突变（saturationmutagenesis）•在一个狭小的基因区域内产生所有或尽可能多的可能的突变•饱和突变的方法–盒式突变–引物诱导的突变饱和突变的方法•盒式突变（cassettemutagenesis）•利用目标基因序列中适当限制酶切位点，插入各种合适的突变DNA片段，用以取代目标基因中特定DNA片段•目标基因序列中有适当限制酶切位点饱和突变的方...
